LncRNA RSU1P2在宮頸癌腫瘤細胞中作為ceRNA拮抗let-7a促進腫瘤發生的影響研究

蔣瓊

·論著·

LncRNA RSU1P2在宮頸癌腫瘤細胞中作為ceRNA拮抗let-7a促進腫瘤發生的影響研究

蔣瓊

目的觀察lncRNA RSU1P2對宮頸癌腫瘤細胞的影響。方法在Caski、HeLa和C33A細胞中通過轉染質粒使RSU1P2過表達，通過MTT試驗和集落形成測定法檢測RSU1P2對細胞活力的影響，用Transwell測定RSU1P2對細胞的轉移和侵襲能力的影響，通過流式細胞儀測定RSU1P2對細胞周期和細胞凋亡的影響通過蛋白(質)印跡法(Western blot)檢測EMT相關蛋白的變化，通過動物實驗測定RSU1P2在體內對宮頸癌組織的影響等。結果在Hela和C33A等細胞中RSU1P2過表達后，細胞增殖能力、轉移侵襲能力和VM均增強(P<0.05)，細胞G1期與S期比例和細胞凋亡數減少(P<0.05)。與對照組相比，RSU1P2-A組裸鼠的平均體重和腫瘤體積的中分別提高了約110%(P<0.05)。結論lncRNA RSU1P2在宮頸癌組織中通過調節let-7A與其靶基因的分配從而促進癌細胞的發生發展。

長鏈非編碼RNA；宮頸癌；ceRNA；Let-7a

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類內生的長度大于200nt的非編RNA，lncRNA自身并不轉錄編碼功能性蛋白質，但參與調控基因在不同水平的表達[1]。LncRNA廣泛參與各種生理過程，如核轉運、選擇性剪接以及表觀遺傳學等。此外，lncRNA也可以作一種結構組件，調控mRNA的穩定以及衰減，甚至可以作為小非編碼RNA(small non-coding RNA，sncRNA)的前體[2]。越來越多的研究發現，許多癌癥細胞中lncRNA的表達異常，如H19是一個長度為2.3 kb的lncRNA，在多種癌癥，包括肝癌、膀胱癌和乳腺癌中異常表達，參與調節腫瘤的增殖與轉移侵襲，這表明lncRNA的異常表達對腫瘤發生有著至關重要的影響[3]。微RNA(microRNAs,miRNAs)是一類長度約為22nt的內源性sncRNA，其主要作用是通過結合mRNA選擇性調控基因的表達，在大多數生物過程中起著顯著作用[4]。成熟的miRNA和與其部分互補的靶RNA結合形成miRNA反應元件(miRNA response elements，MREs)。一個miRNA可以結合多個靶RNA分子，單個靶RNA分子上也可以與多個miRNA分子結合，因此靶RNA分子的表達受到多種miRNA的抑制。在此基礎上，競爭性內源RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)假說，即ceRNA可以通過MREs競爭性結合miRNA從而影響miRNA的功能，抑制miRNA導致的基因沉默[5]。目前，對于在腫瘤中發揮ceRNA功能的lncRNA的了解甚少。在本研究中，我們發現一個lncRNA，RSU1P2(Ras suppressor protein 1 pseudogene 2)。為了探討其在細胞癌變的作用，我們首先證明了與相鄰的非腫瘤組織相比RSU1P2在宮頸癌組織中表達上調，并在宮頸癌細胞作為一種原癌基因。此外，我們發現RSU1P2與miRNA let-7a的結合解除let-7a對其靶基因IGF1R，N--myc和EphA4的抑制，從而發現RSU1P2在宮頸癌腫瘤發生中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本、細胞培養和轉染 從14例宮頸癌患者取其宮頸癌組織樣本和鄰近正常宮頸組織樣本，并提取各個樣本RNA。人宮頸癌細胞株HeLa和C33A由本實驗室既往保存，在RPMI1640培養基(Invitrogen)中培養，該培養基含有10%胎牛血清(FBS)，100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素，置于37℃、CO2體積分數為5%的溫箱內培養。使用脂質體2000試劑(Invitrogen)進行細胞轉染，根據其說明書進行相關操作。本研究已告知患者及其家屬，并簽署知情同意書，并在倫理委員會的指導下開展研究。

1.2 qRT-PCR分析 qRT-PCR分析用于檢測RSU1P2的相對轉錄物水平，let-7a和其靶基因。使用有SYBR 混合液的Taq試劑盒(TaKaRa公司)并根據該試劑盒的說明書進行qRT-PCR擴增及分析。

1.3 miRNA靶標預測 使用RegRNA，TargetScan和PicTar等最常用的預測方法找到let-7a的下游mRNA靶基因。

1.4 Western blot分析 收集細胞，加入適量RIPA裂解液裂解細胞收集細胞蛋白液，加入適量的上樣緩沖液，并在100℃水浴后進行聚丙烯胺凝膠電泳。PVDF膜轉膜后用脫脂奶粉進行封閉，然后用特定的一抗及二抗進行溫育，用化學發光法探測三類細胞中IGF1R，N-myc，EphA4，GAPDH的表達。兔抗人GAPDH，NMYC，IGF1R，EphA4的一抗來自Saierbio(天津，中國)，兔抗人BAK來自Santa Cruz Biotechnology公司(加利福尼亞州，美國)。使用LABWORKS 4.0軟件所得Western印跡條帶進行定量。

1.5 細胞活性和增殖能力的檢測 3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物進行(MTT)法和細胞增殖法來測定評估宮頸癌細胞系的活性和增殖能力。MTT測定中，細胞轉染后20～24 h將8000 C33A細胞或5000 HeLa細胞接種到96孔板。在集落形成測定中，如上述操作將300 C33A細胞或250 HeLa細胞接種到12孔板。所有實驗進行3次以上。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期 2組C33A或HeLa細胞在6孔板中在培養液中培養24 h。其中一組在收集前24 h改用不含血清的培養液培養，而另一組細胞在收集前均在含血清培養液中培養。將細胞通過離心收集，用95%(V/V)乙醇固定，并儲存于-20℃過夜。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌后，將細胞重懸于碘化丙錠(PI)染色緩沖液(PBS，0.1%的Triton X-100，50 μg/ml的PI，0.1 mg/ml的無DNase的RNA酶和0.1%檸檬酸三鈉)放在冰上30 min。用FACS Calibur的流式細胞儀(BD Biosciences公司)和細胞Quest軟件(BD Biosciences公司)檢測分析DNA含量。

1.7 TUNEL法 在HeLa細胞用pcDNA3/RSU1P2或空載轉染后48 h，將經PBS洗滌的細胞并固定在含4%多聚甲醛的PBS，置于室溫下30 min。在PBS中溫育5 min后，在冰上用0.1%(V/V)的Triton X-100對細胞進行透化處理2 min。將樣品用PBS洗滌2次，每次5 min，溫育在混合溶液1 h(酶溶液∶標記溶液= 1∶9，羅氏)并避光。用DAPI(4，6-二脒基-2-苯基，300 nmol/L， Invitrogen)染色之前，將細胞在PBS中洗滌3次，每次5 min。最后一次洗滌后，將樣品與成像系統(NIS Elements F 2.20成像軟件，尼康，東京，日本)可成像檢測。

1.8 EGFP報告基因分析 轉染了pcDNA3/PRI-let- 7aHeLa、對照空質粒、let-7a反義寡核苷酸(ASO)、ASO對照(ASO序列在補充表S1中列出)和上述空載的Hela細胞中在48孔板中培養。表達紅色熒光蛋白(RFP)的表達載體pDsRedz-N1(Clontech)用于歸一化。將細胞用RIPA裂解緩沖液48 h后裂解，并且收集蛋白質。使用熒光分光光度計F-4500(Hitachi)檢測EGFP表達和RFP的表達。所有測定進行3次以上。

1.9 細胞遷移和侵襲實驗 收集轉染后的2組A549細胞，用無血清RPMI-1640培養基重懸，以每孔5×104個的細胞密度加入到預鋪好Matrigel基質膠的Transwell小室的上室內，下室加入600 ml完全培養液，培養箱中常規培養24 h取出上室，用4%多聚甲醛處理后用0.01%結晶紫染色，于200倍光學顯微鏡下計數穿膜細胞數，隨即取5個視野，取平均值。每組實驗設3個復孔，實驗重復3次。

1.10 質粒構建 將含有PRI-let-7a的DNApianduan 導入至BamHI和EcoRI限制性位點之間的pcDNA3載體DNA片段中，得到含pcDNA3/PRI-let-7α(PRI-let-7a)的質粒。用兩條單鏈進行退火反應。將野生型或突變型的mRNA 3’非編碼區插入到pcDNA3/EGFP載體的下游區域的BamHI和EcoRI位點之間。含pUC57-RSU1P2(GENEWIZ)的質粒，含有全部長度的RSU1P2，然后將重建的片段插入BamHI和EcoRI位點之間的pcDNA3載體中，并且所有的構建體通過DNA測序確認。

1.11 在裸鼠腫瘤異種移植模型 共有3×106轉染了pcDNA3/RSU1P2和對照載體的HeLa細胞懸浮于100 μl無血清RPMI 1640培養基中并皮下注入到腋下6周大的雌性裸鼠中。注射7 d后每2天測定小鼠重量和腫瘤大小。腫瘤體積計算如下：腫瘤體積=長度×寬度2×1/2。所有小鼠在注射后20 d處死，將腫瘤從小鼠中分離并儲存在-80℃。

2 結果

2.1 RSU1P2在人宮頸癌組織中表達上調及在體內和體外的致瘤功能 采用qRT-PCR檢測14對宮頸癌組織和鄰近的正常組織RSU1P2的表達水平。結果表明，與相應的非腫瘤組織相比RSU1P2表達水平在宮頸癌組織顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。同時對比RSU1P2在三種宮頸癌細胞：Caski，HeLa和C33A細胞中的表達水平， CaSki細胞的RSU1P2水平最低。另外，由于Hela是HPV陽性細胞系和C33A是HPV陰性細胞系，是代表性的宮頸癌細胞系，故選擇了HeLa和C33A細胞系做今后的研究。用MTT試驗和集落形成測定法檢測細胞活力發現，轉染了RSU1P2-full和shR-RSU1P2的HeLa和C33A細胞系48 h - 96 h 間RSU1P2的顯著表達造成細胞活力增加

和集落形成的能力，而敲除RSU1P2的細胞中這些表型均減少。用Transwell測定細胞的轉移侵襲能力發現，RSU1P2過表達可約2.1倍增加細胞遷移能力和侵襲能力，但sRSU1P2約35%降低這些能力。此外，血管生成擬態(VM)分析顯示為RSU1P2對腫瘤生長起促進作用。結果表明，RSU1P2-full約1.8倍增加的HeLa或C33A細胞的VM，但與對照組比較SHR-RSU1P2則為呈現約40%抑制。為了進一步檢查RSU1P2對體外腫瘤生長的影響，將相應細胞注射入7只裸鼠側腹，20 d后處死裸鼠。與對照組相比，RSU1P2-full組的平均體重和腫瘤的體積增加。見表1、2。

質粒48h72h96hHela pcDNA3238．00±7．23232．00±6．97236．00±7．15 RSU1P2?full290．00±7．18?296．00±6．87?275．00±6．95? pSIH1?H1?copGFP234．00±6．45232．00±6．83243．00±7．03 shR?RSU1P2185．00±5．74#187．00±5．96#172．00±7．00#C33A pcDNA3243．758±7．84243．758±7．69241．839±7．74 RSU1P2?full289．823±7．69?301．339±7．74?297．5±7．52? pSIH1?H1?copGFP239．919±8．04245．677±8．12241．839±7．86 shR?RSU1P2193．855±7．46#203．452±7．49#186．177±7．58#

注：與pcDNA3比較，*P<0.05;與pSIH1-H1-copGFP比較，#P<0.05

質粒增殖細胞數遷移細胞數穿膜細胞數VMHela pcDNA3144．593±5．64150．619±6．87144．862±4．68210．198±7．94 RSU1P2?full299．697±4．57?299．543±5．63?221．862±4．51?390．397±6．43? pSIH1?H1?copGFP141．867±5．36145．809±6．35143．465±4．72210．232±7．38 shR?RSU1P243．178±5．39#56．071±7．58#40．045±5．32#142．568±7．84#C33A pcDNA3141．121±5．25144．597±6．24140．399±4．37182．083±7．16 RSU1P2?full219．733±4．36?194．929±6．31?312．112±5．07?340．309±8．10? pSIH1?H1?copGFP141．907±5．18146．693±6．35142．587±4．68183．16±7．57 shR?RSU1P260．5805±4．67#65．6141±6．47#62．3919±4．28#118．042±6．73#

注：與pcDNA3比較，*P<0.05;與pSIH1-H1-copGFP比較，#P<0.05

2.2 RSU1P2的let-7的結合區域促進宮頸癌發生 為避免其他的miRNA干擾，本研究選擇RSU1P2的一個21bp的片段，其包含let-7a中結合位點，構建含pcDNA3/RSU1P2-fragment A(pRSU1P2-A)的載體。RSU1P2-A促進了HeLa和C33A細胞的細胞活力、增殖能力、遷移和侵襲能力,與對照相比pRSU1P2-A增強了Hela和C33A中VM的形成。在裸鼠實驗中與對照載體組相比較，RSU1P2-A組的平均體重和腫瘤體積的中分別提高了約110%。見表3、4。

2.3 RSU1P2促進細胞周期進程和EMT并減少細胞凋亡 RSU1P2-A過表達造成HeLa細胞中G1期細胞比例減少(從57.5%到48.9%)，S期細胞增加(從22.1%到30.5%)，與之相反，在敲除RSU1P2的HeLa細胞中G1期細胞的積累和S期細胞減少。RSU1P2-A處理的Hela細胞的增殖指數明顯高于陰性對照，并且SHR-RSU1P2處理的Hela細胞增殖指數降低。在用pcDNA3/RSU1P2或SHR-RSU1P2處理的C33A細胞中亦觀察到同樣的現象。用TUNEL可視化測定凋亡細胞，結果表明與對照組相比pRSU1P2-A轉染的細胞表現出凋亡減弱。在Western Blot實驗中RSU1P2-A表達導致E-cadherin的減少以及Vimentin和ICAM-1的增加，在表達shR-RSU1P2的HeLa細胞則有完全相反的結果。見表5、6，圖1。

質粒48h72h96hHela pcDNA3130．023±6．34136．157±6．75138．627±6．29 pRSU1P2?A203．406±6．39?193．066±5．93?186．417±6．08?C33A pcDNA3203．333±6．96200．709±7．35196．602±7．10 pRSU1P2?A284．093±6．82?293．743±7．26?308．003±7．08?

注：與pcDNA3比較，*P<0.05

質粒增殖細胞數遷移細胞數穿膜細胞數VMHela pcDNA3205．473±5．83183．293±5．7378．9028±6．01190．286±6．12 pRSU1P2?A476．924±5．74?478．926±5．82?350．005±6．14?408．321±6．08?C33A pcDNA3194．502±5．89171．467±6．3284．972±6．89194．25±7．23 pRSU1P2?A299．957±5．94?248．332±6．29?169．944±6．73?327．054±7．35?

注：與pcDNA3比較，*P<0.05

質粒細胞增殖數Hela pcDNA3258．351±5．35 pRSU1P2?A388．908±6．20? pSIH1?H1?copGFP259．395±5．71 shR?RSU1P2147．585±6．18?C33A pcDNA3243．852±5．47 pRSU1P2?A337．031±6．16# pSIH1?H1?copGFP241．869±5．38 shR?RSU1P2124．9±6．05#

注：與pcDNA3比較，*P<0.05;與pSIH1-H1-copGFP比較，#P<0.05

質粒E?cadherinVimentinICAM?1pcDNA3258．24±3．42262．461±3．56263．509±3．58pRSU1P2?A213．038±3．45?360．395±3．62?339．4±3．29?pSIH1?H1?-copGFP276．193±2．87278．325±2．47275．702±32．68shR?RSU1P2374．763±2．92#172．246±2．41#214．048±2．74#

注：與pcDNA3比較，*P<0.05;與pSIH1-H1-copGFP比較，#P<0.05

2.4 RSU1P2是let-7A的靶基因 通過堿基互補配對發現RSU1P2序列含有let-7a的結合區。將let-7a序列中含6個堿基突變的野生或突變片段連接在EGFP報告基因的下游進行克隆擴增，并與PRI-LET-7A或ASO-LET-7A一起分別轉染HeLa細胞，與對照組相比let-7a的表達導致EGFP強度均減少了近31%，而ASO-let-7a細胞中EGFP強度則增加了2.2倍。qRT-PCR檢測表明，let-7a的過度表達可約78%抑制RSU1P2的水平，而ASO-let-7A則可誘導RSU1P2，5倍增強其表達水平。見圖2。

2.5 RSU1P2作為為let-7a的ceRNA調控相關基因 在HeLa細胞RSU1P2-A的表達阻遏了let-7a的抑制作用，但SHR-RSU1P2抑制兩種轉錄產物和let-7A的靶基因IGF1R，N--MYC和EphA4表達的蛋白質水平。此外，let-7A表達水平與RSU1P2表達水平呈負相關，轉染pRSU1P2-AHeLa細胞中let-7a的表達水平降低了50%，但轉染SHR-RSU1P2的Hela細胞中let-7a表達水平顯著增加約15倍。RSU1P2-A的表達顯著增強IGF1R，N-myc和EphA4中EGFP強度；相反SHR-RSU1P2則顯著減少了其EGFP強度。但let-7a水平的改變對含有3'UTR突變載體的let-7A靶細胞中的EGFP強度沒有影響。 qRT-PCR反映，與對照相比轉染pRSU1P2-A的小鼠這三個靶基因的表達均增加。qRT-PCR分析表明，患者樣本中let-7a的表達下降，但在宮頸癌組織與相鄰非腫瘤組織相比較，其靶基因RSU1P2表達增加。此外，在14對臨床宮頸癌組織樣本中IGF1R、N-myc和EphA4普遍有高水平的表達。為了證明RSU1P2 CERNA的作用是通過let-7a中的結合位點驅動的，我們僅表達野生型或轉染含let-7A突變片段的RSU1P2的HeLa細胞并檢測其細胞增殖。MTT、集落形成實驗、透孔遷移和侵襲實驗、VM和western blot分析表明，RSU1P2能抑制let-7A對惡性表型和其靶基因的作用。見表7～13。

圖1 RSU1P2加速細胞周期進程，抑制細胞凋亡并促進體外EMT過程。 在HeLa(A)和C33A(B)細胞中通過流式細胞儀分析轉染細胞的細胞周期進程(逐級)。 HeLa細胞中的TUNEL檢測 通過TUNEL(綠色熒光)顯示凋亡小體，細胞核被DAPI染色(藍色熒光)(C)

圖2 RSU1P2作為let-7a的直接目標的驗證。顯示了預測的let-7a結合位點和含有野生型或突變體結合位點的RSU1P2區段的序列。 將RSU1P2(RSU1P2 WT)和缺失let-7a結合位點的突變體衍生物克隆到EGFP編碼區的下游

質粒RNA表達水平IGF1RN?MYCEphA4蛋白質表達水平IGF1RN?MYCEphA4pcDNA3119．32±3．45121．84±4．12120．57±4．20277．69±3．51126．05±3．48171．93±3．65pRSU1P2?A244．35±3．52?313．08±4．08?374．26±4．26??434．93±3．62?341．55±3．50?128．43±3．56?pSIH1?H1?copGFP121．47±3．46118．32±4．15118．96±4．15276．63±3．16130．12±3．21169．86±3．68shR?RSU1P242．15±3．41#56．01±4．11#33．95±4．17#185．46±3．12#63．02±3．19#455．71±3．72#

注：與pcDNA3比較，*P<0.05，與pSIH1-H1-copGFP比較，#P<0.05

質粒IGF1RN?MYCEphA4pcDNA3343．24±6．46345．12±5．73352．67±6．47pRSU1P2?A290．43±5．89?371．53±5．85?337．58±5．42?pSIH1?H1?copGFP345．13±5．82343．24±6．12339．47±6．25shR?RSU1P2286．66±6．04#356．44±6．32#320．61±5．97#

注：與pcDNA3比較，*P<0.05，與pSIH1-H1-copGFP比較，#P<0.05

質粒let?7a的表達水平pcDNA3153．56±3．67pRSU1P2?A72．50±3．12?pSIH1?H1?copGFP156．57±3．27shR?RSU1P2398．05±3．69?

注：與pcDNA3比較，*P<0.05

質粒IGF1RN?MYCEphA4pcDNA30．21±4．250．21±9．820．20±9．07pRSU1P2?A0．70±5．42?0．82±6．53?0．62±6．77?

注：與pcDNA3比較，*P<0.05

質粒48h72h96hpcDNA3+pri?let?7a0．52±6．730．50±7．410．53±6．92pcDNA30．70±6．95?0．70±7．11?0．69±8．73?pri?let?7a+pRSU1P2?A0．90±6．99#0．92±4．57#0．84±6．37#

注：與pcDNA3+pri-let-7a比較，*P<0.05;與pcDNA3比較，#P<0.05

質粒增殖細胞數遷移細胞數穿膜細胞數VMpcDNA3+pri?let?7a0．39±6．380．54±6．250．56±5．830．31±5．89pcDNA30．67±6．15?0．69±6．20?0．71±5．39?0．69±4．78??pri?let?7a+pRSU1P2?A0．72±6．27#0．76±6．14#0．77±5．72#0．81±5．78#

注：與pcDNA3+pri-let-7a比較，*P<0.05;與pcDNA3比較，#P<0.05

質粒IGF1RN?MYCEphA4pcDNA3+pri?let?7a0．78±4．030．44±7．350．47±6．98pcDNA31．04±7．24?1．04±5．33?1．03±6．67?pri?let?7a+pRSU1P2?A0．96±6．08#1．134±5．47#1．00±6．26#

注：與pcDNA3+pri-let-7a比較，*P<0.05;與pcDNA3比較，#P<0.05

3 討論

哺乳動物基因組的高通量研究已經揭示，哺乳動物基因組可被轉錄成數萬種lncRNAs[1]。雖然一小部分lncRNAs已經發現其功能特征，但大部分的lncRNA的功能是未知的。最近，出現的報告表明，lncRNAs是在各種癌癥中起著重要的作用，存在致癌和抑癌兩種潛在作用[6-8]。在回顧lncRNA數據庫及相關文獻中發現RSU1P2是Ras抑制蛋白的偽基因，在最近的研究中RSU1P2已經顯示出與RSU1不同的功能[9]。 RSU1(約33 kD)能抑制Ras依賴的原癌基因的轉化，從而促進細胞粘附和侵入，且降低細胞增殖[28]。 RSU1的沉默導致乳腺癌細胞增殖及抑制其細胞凋亡[10]。但是目前對RSU1P2的功能還不清楚。了解lncRNAs對生理和病理條件的影響對說明lncRNAs的功能和調節機制是至關重要的。

通過本研究中的實驗可以的出一些重要的結論。首先，RSU1P2在Hela和C33A細胞中表達顯著增加，表明RSU1P2在宮頸癌組織中高表達，并能提高增殖、血管生成、侵襲和遷移能力，促進EMT和HeLa和C33A細胞的G1/S轉變，從而充當癌基因的角色。此外，動物實驗證明RSU1P2可促進宮頸癌腫瘤的發生，故RSU1P2在體內和體外均可以發揮致瘤的功能。第二， RSU1P2螯合let-7a可以有效地擾動let-7a與其靶基因IGF1R，N-myc和EphA4的之間的相互作用。大量的研究已經證明，IGF1R和N-myc基因是let-7家族的靶基因[10，11]，也有研究報道EphA4的是let-7a的靶基因[12]。 IGF1R在各種癌癥細胞中顯著表達，通過激活細胞內的PI3K和MAPK途徑致癌，而且促進細胞增殖和轉移[13,14]。 N-myc基因是Myc家族原癌基因中的一種，在神經母細胞瘤細胞中高表達，可作為治療失敗的遺傳標記。有研究報道N-myc基因也可促進神經細胞瘤細胞的遷移[15]。 EphA4基因屬于Eph受體酪氨酸激酶家族，并已被證明在不同類型的人類癌癥中發揮作用[6,17]。 EphA4在人腦膠質瘤U251細胞系中通過EphA4-FGFR1途徑促進細胞的增殖和遷移[18]， 結直腸癌發生肝轉移和EphA4基因的高度表達與EphB2基因的低表達相關[19]。本研究結果表明RSU1P2在宮頸癌腫瘤細胞中作為ceRNA促進癌細胞的發生發展，而且在體外的人臨床樣本中得到了同樣的結果：與相應的鄰近正常組織相比，宮頸癌組織樣本中let-7A表達下降而RSU1P2表達增加。此外，生物信息學分析發現RSU1P2含有其他的miRNA，如miR-122、 miR-143和miR-9的多個結合位點，因此RSU1P2可調節miRNA分子及其靶基因的分布，形成了RNA-RNA調節通路。

綜上所述，通過調節let-7A與其靶基因的分配RSU1P2可以促進癌細胞的發生發展。了解RSU1P2對惡性腫瘤細胞的影響有助于闡明宮頸癌的發病機制，為宮頸癌的靶向治療提供新依據。

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EffectsofLncRNARSU1P2oncervicalcancercellsinvitro

JIANGQiong.

DepartmentofGynecology,TCMHospitalofShiyanCity,Hubei,Shiyan442012,China

ObjectiveTo observe the effects of LncRNA RSU1P2 on cervical cancer cells in vitro.MethodsThe overexpression of RSU1P2 was performed by transfection plasmid in Caski,HeLa and C33A cells,then the effects of RSU1P2 on cell vitality were detected by MTT test and colony formation assay.Moreover the effects of RSU1P2 on cell metastasis and invasion ability were measured by Transwell,and its effects on cell cycle and cell apoptosis were determined by flow cytometry. The changes of EMT related protein were detected by Western Blot.Besides the effects of RSU1P2 on cervical cancer tissues of nude mice were detected in vivo.ResultsAfter overexpression of RSU1P2 in Hela and C33A cells,the cell abilities of proliferation,metastasis,invasion and VM were significantly increased (P<0.05),and the cell proportion at phase G1,phase S and the number of apoptotic cells were significantly decreased (P<0.05).As compared with those in control group,the average weight and tumor volume in nude mice with RSU1P2-A were increased by approximately 110% (P<0.05).ConclusionThe lncRNA RSU1P2 can promote the pathogenesis and development of cervical cancer by regulating the distribution of let-7A and its target genes.

long chain non-coding RNA; cervical cancer; ceRNA; Let-7A

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.20.001

R 711.74

A

1002-7386(2017)20-3045-06

2017-04-16)

442012 湖北省十堰市中醫醫院婦科