湖棲鰭蝦虎魚在發育生物學綜合性實驗中的應用初探

王中鐸+郭昱嵩+劉皓+劉麗+劉楚吾

【摘 要】以湖棲鰭蝦虎魚為實驗材料，從受精、正常胚胎發育過程的觀察，環境因素對胚胎發育的影響，內分泌干擾物的濃度梯度刺激對胚胎發育的形態學觀察及相關基因表達水平的檢測等一系列連續實驗的設計，可為生物科學專業發育生物學的綜合性實驗設計提供參考，使學生掌握一系列發育生物學的基本實驗技術，增強學生對知識的理解層次，培養學生的科研興趣。

【關鍵詞】發育生物學；綜合性實驗；湖棲鰭蝦虎魚

發育生物學的產生是以胚胎學為基礎，并融入分子生物學、細胞生物學、遺傳學和生物化學等學科的相關知識和技術，從20世紀70年代開始形成一門獨立的學科，近年來取得了巨大進展，成為解釋生物個體發育的基礎學科，也成為生命科學領域最活躍的學科之一。國內外各高等院校紛紛開設發育生物學作為本科生的專業基礎課程，并開設實驗教學課程以增加學生理解層次及培養學生科學思維和綜合素質[1-3]。發育生物學實驗內容包括生殖細胞的發生、受精、個體發育的過程、功能基因表達基因調控的機制和原理、發育與環境的關系、凋亡和再生、發育與進化等等；同時吸納了分子生物學、遺傳學、胚胎學等很多領域的研究手段。發育生物學發展速度快、但架構不成熟。相比其他生物學分支學科，發育生物學實驗教學還處于剛剛起步階段，統一的、可廣泛接受和采納的教學體系還沒有形成[4]。傳統的發育生物學實驗教學內容中相當比重來源于胚胎學實驗，主要是作為理論教學的補充，以驗證性實驗為主，而綜合性、設計性的實驗內容相對比較少，對學生綜合素質、創新能力的培養沒有得到足夠重視[5]。通過綜合性的實驗，能夠充分發揮實驗教學作用，使學生從準備實驗材料、藥品試劑到具體實驗操作的整個實驗教學過程中都基本能獨立完成，掌握發育生物學的基本實驗技術，并且能養成和增強學生良好的創新思維習慣，從而提高發現問題、分析問題和解決問題的能力[6]。但是，至目前為止，由于受到專業領域和實驗條件的限制，開設發育生物學實驗課程的高等院校還是比較少，難以實現和達到發育生物學的實驗目標和對理論課的輔助作用。廣東海洋大學水產學院自2002年起對海洋生物學專業本科生開設了發育生物學理論課及實驗課，并且不斷改革進行和完善發育生物學實驗教學體系，于2009年開設了以硬骨魚類（如金魚、胡子鯰）和兩棲類（如虎紋蛙等）為實驗材料的適合于水產類的發育生物學綜合性實驗，取得了較好的教學效果，但由于實驗材料的可操控性不強，使得實驗開設的成功率和有效率降低[7]。

由于模式生物具有生理特征能夠代表生物界的某一大類群、容易獲得并易于在實驗室內飼養繁殖及容易進行實驗操等優點。為了不受限于實驗材料，基于模式生物的《發育生物學》實踐教學改革勢在必行。至今廣泛使用的水產魚類模式主要有源自亞洲其他地區的斑馬魚、日本青鳉魚，北美洲的三棘刺魚等。以斑馬魚為例，該淡水魚類原分布于本魚分布于孟加拉，印度，巴基斯坦，緬甸，尼泊爾的溪流。上世紀50年代開始被引進美國、德國等實驗室進行開發應用?，F已成為全世界廣泛接受的實驗模型之一。綜合而言，一方面斑馬魚具有模式生物共有的特點： 1）作為觀賞魚類之一，容易獲得并易于在實驗室內飼養和繁殖；2）受精后3天即可發育出膜，7天開口攝食，3個月既可完全成熟，世代短；3）3-5天可以產卵一次，每次可以產多達200顆成熟卵，因此子代多；4）其基因組已經測定，且已經建立許多純系，因而遺傳背景清楚；5）容易進行實驗操作，特別是具有遺傳操作的手段和表型分析的方法。另一方面，斑馬魚具有自身獨有特色，有利于回答研究者關注的問題：1）能夠很好代表生物界脊椎動物最大的水生硬骨魚類中的淡水鯉科類群；2）不會像鼠類、靈長類等導致人類的過敏等影響，對人體和環境無害；3）受精卵到出膜早期均透明，容易觀察和操作。

為了更好的與本土資源開發和利用研究相結合，本文利用本地紅樹林海區的廣鹽性魚類湖棲鰭蝦虎魚作為潛在的模式生物開發，輔助斑馬魚、青鳉為研究對象進行發育生物學綜合性實驗教學的改革探索。

湖棲鰭蝦虎魚（Gobiopterus lacustris）是本實驗室對廣東省雷州半島主要紅樹林海區進行魚類資源調查時發現的中國鰭蝦虎魚屬一新紀錄。于高橋鎮紅樹林保護區，東海島紅樹林海區，雷州市調風鎮九龍山紅樹林國家濕地公園，附城鎮北家村，下六鎮紅蒔地村等附近的河流入?？诨驕\灘中均發現有湖棲鰭蝦虎魚的分布，并經COI基因區段測序分析確認[8]。成魚魚體半透明，無色或淡黃色，可以清晰地看見脊椎骨、肋骨、魚鰾、腸和性腺等腹部的器官。雌魚性腺中成熟的卵細胞清晰可見，也可看雄魚成熟性腺呈黃色。上、下頜圍有深色花斑，頭部分散著許多黑色花斑或斑點。背面上背鰭兩側各有一行斑點從頭部直通尾部。腹鰭、腹部和臀鰭兩側均有花斑。腹部向后，沿著髓棘和肋骨均分布有花斑。每一條鰭棘或鰭條上均分布有斑紋。可以通過生殖乳突、牙齒、性腺等形態學指標區分雌雄成魚個體。

分布于雷州半島的湖棲鰭蝦虎魚數量多，且半島兩側均有分布，是這一地區的優勢種[9]。由于湖棲鰭蝦虎魚生活在淡水與海水交匯的紅樹林海區，因此其適應的鹽度較廣，其個體小易養殖，體色半透明，用肉眼或借助體式顯微鏡就能觀察到體內變化情況，相比較于斑馬魚、青鳉等現有的模式生物，湖棲鰭蝦虎魚成體優勢明顯，具有開發為模式生物或環境指示物種的潛力。

湖棲鰭蝦虎魚易于人工養殖，已經開發完善了一套較為完備實驗室養殖規程。具體如下：養殖水體要經尼龍、生物吸附劑、活性炭、生化過濾器及紫外殺菌系統處理， 溶解氧水平為4-8mg/L，水溫為26-30℃。養殖生長期為0.2-0.5L/尾。在實驗室培養下成活率高，溫度鹽度耐受性廣。缺點在于截至目前，該魚尚無法完成實驗室的全人工繁育過程，需要在野外采集成熟雌雄個體進行自然產卵。將幾種模式魚類可以進行優勢互補，對實驗進行多角度分析。

與斑馬魚、青鳉魚相比，湖棲鰭蝦虎魚的優勢在于從魚卵發育到成魚不用化學處理均呈現透明狀態，非常方便在體式鏡下觀察發育過程。湖棲鰭蝦虎魚作為實驗材料的優勢在于胚胎發育歷程遵循硬骨魚類發育的模式，經歷受精激活期、胚盤期、囊胚期、原腸胚期、神經胚期、器官形成期、出膜期這八個階段，各個時期都有明顯的特征，可以完整的跟蹤觀察胚胎到完全發育為仔魚的過程。尤其，基于湖棲鰭蝦虎魚的透明成體，可以方便我們進行活體條件下成體性腺、肝臟等內臟器官的形態追蹤觀察，對科研教學有很好的意義[9]。endprint

針對湖棲鰭蝦虎魚的這些特點，我們設計開展發育生物學觀察實驗。首先，讓學生通過與斑馬魚沉性卵的比較，充分認識湖棲鰭蝦虎魚的粘性卵特點，并思考和討論不同魚類受精卵的生態適應和演化機制；其次，通過受精卵不同鹽度下的孵化速率和出膜率的比較，認識廣鹽性魚類對于鹽度的適應性發育能力；再次，比較不同模式魚類之間出膜時間周期，出膜后魚體的發育程度和仔魚的活動能力；第四，充分利用湖棲鰭蝦虎魚成體透明的特點，觀察從仔稚魚到成體轉變過程中內部器官的轉變過程，以及攝食等不同生活狀態下消化系統、血液循環系統的運作；最后，觀察性成熟的雌雄個體性腺在不同發育分期下的形態轉變，為毒理學實驗打基礎。

我們還針對湖棲鰭蝦虎魚設計急性和慢性毒理實驗。急性實驗方面，使用較大濃度的壬基酚等典型的近岸常見污染物處理湖棲鰭蝦虎魚，然后觀察形態改變，行為異常并獲取半致死濃度等數據。慢性實驗方面，使用較低的不同劑量濃度壬基酚等處理湖棲鰭蝦虎魚?？紤]到慢性實驗周期較長，我們需要設置多個觀測時間點，安排在課程的多個階段，分別開展多方面的實驗，具體包括：觀察記錄外部形態以及肝臟、性腺等內臟狀態、測量相應的長度和重量；測定抗氧化氣化酶等常規酶變化；qPCR定量ChgL等基因的表達。通過急慢性的毒理學實驗，是學生能夠全面認識內分泌干擾物的暴露對魚類個體發育不同階段的影響，從而充分認識環境保護工作的重要性。

根據發育生物學實驗的教學要求，通過以實驗室方便人工養殖和操控觀察的硬骨魚類湖棲鰭蝦虎魚為材料，從受精、正常胚胎發育過程（包括內部和外部結構）、環境因素對胚胎發育的影響、內分泌干擾素濃度梯度對胚胎的影響以及檢測胚胎發育過程中相關基因的表達水平等，設計一系列連貫實驗讓學生進行操作，可為發育生物學的綜合性實驗設計及本科生開放實驗項目提供參考。通過以上的實驗，使得學生掌握一整套發育生物學的實驗技術，增強學生的科研興趣，培養學生的科研素養，提高學生分析問題和解決問題的能力。

【參考文獻】

[1]丁漢波，全允翔，黃浙.發育生物學[M].北京：高等教育出版社，1987.

[2]樊啟昶，白書農.發育生物學原理[M].北京：高等教育出版社，2002.

[3]張祥沛，郭炳冉.生物學實驗研究[M].2版.青島：中國海洋大學出版社，2000.

[4]董巍，張媛，許崇任.改革創新發育生物學實驗教學的實踐與思考[J].高校生物學教學研究，2014，4（1）：46-50.

[5]郭炳冉，鮑淑蘭.規范發育生物學實驗教學內容的思考[J].實驗技術與管理，2008，25（9）：23-24.

[6]李登文，周軍.細胞生物學綜合性實驗的設計[J].實驗室研究與探索，2008，27（4）：100-101.

[7]劉皓，劉麗，李鋒，郭昱嵩，劉楚吾.海洋生物專業發育生物學綜合性實驗設計初探——硬骨魚的人工催青、受精、早期胚胎發育及其調控[J].湛江師范學院學報， 2014，35（5）：1-3.

[8]廖健，張順，龍水生，等.5種蝦虎魚類線粒體COI基因序列變異及系統進化[J]. 廣東海洋大學學報，2016，36（1）：7-12.

[9]廖健，張順，賀亮，等.基于DNA條形碼技術的雷州半島紅樹林海區仔稚幼魚物種多樣性研究.第三屆環北部灣高校研究生海洋論壇[C].湛江：廣東海洋大學， 2015：175-183.

[責任編輯：朱麗娜]endprint