急性應激后小鼠空間學習記憶及腦內HIF—1α表達的變化

高曉曉+張雅普+李亞

【摘 要】目的 研究急性應激強度下小鼠學習記憶能力的變化以及海馬和前腦皮層HIF-1α的表達。方法 采用電擊足底方式對小鼠急性應激處理，通過Morris水迷宮實驗檢測小鼠的空間學習記憶能力，采用免疫組織化學方法檢測小鼠海馬和前腦皮層缺氧誘導因子（HIF-1α）的表達。結果 急性應激組小鼠在水迷宮實驗中的空間學習記憶能力比正常對照組小鼠明顯增強（P<0.05）；腦內海馬CA1區、CA3區、齒狀回和前腦皮層HIF-1α的表達顯著增加（P<0.01）。結論 急性應激后，HIF-1α在海馬和前腦皮層表達增加，可能參與應激引起小鼠學習記憶功能的增強。

【關鍵詞】急性應激；空間學習記憶；HIF-1α； 海馬；前腦皮層

【Abstract】Objective To study the changes of spatial learning-memory ability after acute stress， and the expression of Hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α） of prefrontal cortex （PFC） and hippocampus （HP） in mice brain. Methods The acute stress model mice with foot shock were applied. The spatial learning- memory in mice was determined by Morris water maze task， and the expression of HIF-1α in HP and PFC were observed by immunohistochemical method. Results Compared with the control group mice， the ability of spatial learning and memory in acute stress group mice were significantly increased （P<0.05）. The expression of HIF-1α in CA1， CA3 and dentate gyrus of HP and PFC were significantly enhanced in acute stress group mice （P<0.01）. Conclusion The enhancement of learning-memory function induced by acute stress in mice， which may be nearly associated with the up-regulated of HIF-1α expression in HP and PFC.

【Key words】acute stress； spatial learning and memory； HIF-1α； hippocampus； PFC

機體處于一定的社會環境中，總有類似的包括壓力、刺激、驚嚇、緊張等刺激使機體產生應激反應，由于這些刺激的強度、來源以及時間和頻率出現的不可預見性，將對人類的身心健康產生不同程度的影響。研究表明，適宜強度的應激對于機體而言是有利的[1]，將有利于提高機體對外界刺激的警覺能力，使機體反應更加敏銳，提高對周圍環境的適應能力，有助于機體提高自身技能，包括對外界環境的探索能力以及部分腦區的高級活動，如學習記憶功能的改善。

研究表明，在接受外界不同程度的刺激過程中，體內激素水平及相關蛋白表達會發生相應的而變化。缺氧誘導因子（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α），是一種轉錄激活因子[2]，介導多種細胞和系統缺氧時的穩態維持；研究表明，HIF-1α的下游靶基因如促紅細胞生成素（EPO）以及血管內皮生長因子（VEGF）等皆為保護樣神經因子[3]。本研究采用急性應激處理小鼠，檢測小鼠在水迷宮中的空間學習記憶能力以及前腦皮層和海馬HIF-1α的表達，探討在一定的應激強度下，小鼠學習記憶的改變與HIF-1α的聯系。

1 材料與方法

1.1 動物分組及應激方法

昆明品系小白鼠，3月齡，體重18～20g；雌雄各半。濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK（魯）20140007。購買后的小鼠于實驗室環境下適應一周，提供充足的食物和水。急性應激方法采用電擊足底，強度36v，30s/次，間隔15s刺激一次，共30次。對急性應激組小鼠實施足底電擊，正常對照組小鼠不接受實驗應激源，正常飼養。

1.2 Morris水迷宮檢測小鼠的空間學習記憶能力

采用Morris水迷宮檢測各組小鼠的空間學習記憶能力。水迷宮由一圓形水池和一可移動隱匿的平臺組成，水池直徑80 cm，高50 cm，分為四個象限，平臺置于第一象限（目標象限）。測試過程分兩部分：第一部分，定位航行實驗。實驗中將小鼠頭部用苦味酸染色，以使得實驗系統可以跟蹤到小鼠。小鼠從四個象限入水，記錄不同組小鼠從不同位置入水至爬上平臺所需要的時間，求得各組小鼠的逃避潛伏期（ escape latency），逃避潛伏期越短，小鼠空間學習能力越強。第二部分，空間搜索實驗。將平臺撤掉，將小鼠從第三象限入水，記錄小鼠在原平臺象限的停留時間。小鼠在原平臺象限停留時間越長，小鼠的空間記憶能力越強。

1.3 小鼠腦內海馬區和前腦區HIF-1α的表達

在水迷宮實驗結束后，用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，采用灌流取腦技術將小鼠的腦組織取出，經多聚甲醛溶液中后固定2小時，PBS沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋等過程，切片后采用免疫組織化學技術檢測小鼠相關腦區HIF-1α的表達情況。免疫組化過程均按照試劑盒（武漢博士德生物公司）說明進行。最后選取每只小鼠海馬CA1區、CA3區、齒狀回（DG）以及前腦皮層（PFC）切片3張，每張圖片隨機選取2個相應部位。采用Motic Images Advanced3.2圖像處理系統計算HIF-1α陽性神經元平均目標灰度值。endprint

1.4 統計學處理

數據采取平均數±標準誤（M±SE）的方式來表示。其中，Morris水迷宮逃避潛伏期數據處理采用重復測量方差分析（repeated-measures ANOVA）；各象限游泳時間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各組間數據的比較采用Newman-Keuls法進行分析；其他數據的組間比較采用非配對t檢驗， 以P <0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠Morris水迷宮空間學習記憶能力檢測

定位航行實驗數據經過統計學分析顯示（表1），正常對照組和急性應激組小鼠的逃避潛伏期均迅速下降（F=6.378，P<0.01；F=8.546，P<0.01）。與正常對照組比較，急性應激組小鼠的逃避潛伏期在第二、三和四訓練周期，均明顯縮短，有顯著性差異（P<0.05）。結果表明，急性應激可增強小鼠的空間學習能力。

空間搜索實驗中小鼠在各象限停留時間結果顯示（表2），正常對照組和急性應激組小鼠在第一象限（目標象限）停留的時間比其他三個象限的停留時間均顯著增長（F=5.783，P<0.05；F=9.675，P<0.01）；與正常對照組相比，急性應激組小鼠在目標象限停留時間顯著增長（P <0.05）；而在目標象限的相對象限（第三象限）停留時間明顯縮短（P<0.01）。結果表明，急性應激可增強小鼠對原平臺記憶的保持能力。

2.2 各組小鼠海馬和前腦皮層HIF-1α的表達情況

各組小鼠HIF-1α表達的免疫組織化學染色顯示，在海馬和前腦皮層都有廣泛表達。統計結果顯示，與正常對照組比較（表3），急性應激組小鼠前腦皮層（PFC）和海馬CA1、DG區HIF-1α陽性神經元平均目標灰度值顯著減少（P<0.01，P<0.05，P<0.01），在CA3區差異不顯著。結果表明，急性應激后小鼠海馬和前腦皮層HIF-1α的表達增強。

3 討論

相關研究顯示，適當的應激會提高小鼠的學習記憶能力，而過強的應激則會使小鼠和人的學習記憶能力低下[4]。研究表明，應激會導致機體垂體-腎上腺皮質及交感-腎上腺髓質功能增強，明顯影響機體的學習和記憶能力[5]。也有研究顯示，慢性應激導致動物學習記憶能力低下，空間學習記憶受損；這可能與應激強度以及時長相關。我們實驗室先前的研究表明，急性應激明顯增強小鼠的空間學習記憶能力，這種效應可能與海馬和前腦皮層GDNF的表達密切關系[6]。本實驗結果表明，急性應激后小鼠在Morris水迷宮中的逃避潛伏期顯著縮短，目標象限停留時間明顯延長，說明急性應激后小鼠的空間學習記憶能力顯著增強。

HIF-1在哺乳動物中廣泛表達，對氧氣的穩態調節起重要作用，是具有轉錄活性的核蛋白。受缺氧調控的 HIF-1α 是活性亞基，HIF-1α在常氧時合成和降解同時發生，經脯氨酸羥化（Prolylhydroxylase，PHD）羥化修飾后降解，維持在低水平。有研究報道，在使用了HIF-1α的抑制劑PHD后，小鼠海馬記憶能力明顯提高；而癡呆模型大鼠的HIF、EPO表達與學習記憶能力呈高度正相關[7]。研究表明，HIF-1α可通過 MAPK信號通路和PI3K/Akt信號通路表達調控其下游因子[8]。相關研究顯示，EPO mRNA的表達是以HIF的表達為基礎的，高劑量EPO有助于改善動物的學習記憶[9]，而在敲除HIF-1α基因后，VEGF等因子并不能被正常激活。本研究結果表明，急性應激后，小鼠海馬各區和前腦皮層HIF-1α陽性神經元平均灰度值明顯降低，海馬和前腦皮層HIF-1α的表達顯著增強。因此，可以推測，機體可能通過提高HIF-1α表達來激活其靶基因的表達如EPO以及VEGF等保護因子，來實現對學習記憶能力的調節。

【參考文獻】

[1]Lupien SJ， McEwen BS， Gunnar MR， et al. Effects of stress throughout the lifespan on the brain， behaviour and cognition[J]. Nat Rev Neurosci， 2009， 10（6）： 434-445.

[2]Majmundar AJ， Wong WJ， Simon MC. Hypoxia inducible factors and the response to hypoxic stress[J]. Mol Cell， 2010， 40（2）： 294-309.

[3]湯盈，等.缺氧誘導因子-1（HIF-1）對促紅細胞生成素（EPO）等靶基因表達的影響[J].四川體育科學，2006，（3）：26-29.

[4]嵇志紅，高偉.應激對動物行為和學習記憶能力的影響[J].大連大學學報，2002，（4）： 81-84.

[5]McEwen BS. Protective and damaging effects of stress mediators： central role of the brain [J].Dialogues Clin Neurosci，2006，8（4）：367-381.

[6]陳亞靜，史建勛，張冠雄，等.急性應激對小鼠空間學習記憶功能及腦內GDNF表達的影響[J].科技信息.2012，9：24-25.

[7]張蓓，吳海琴，等.低氧誘導因子-1、促紅細胞生成素在血管性癡呆大鼠海馬的表達[J].四川大學學報（醫學版），2006，（5）：730-733.

[8]Cavadas MA， Nguyen LK， Cheong A. Hypoxia-inducible factor （HIF） network： insights from mathematical models [J]. Cell Commun Signal， 2013， 11：42.

[9]Adamcio B， Sperling S， Hagemeyer N， et al. Hypoxia inducible factor stabilization leads to lasting improvement of hippocampal memory in healthy mice [J].Behav Brain Research，2010，208（1）：80-84.

[責任編輯：張濤]endprint