液相色譜-串聯質譜法同時測定嬰幼兒配方奶粉中12種水溶性維生素

耿健強，趙麗，潘紅艷，邵明媛，王浩

（國家食品質量安全監督檢驗中心，北京市食品安全監控和風險評估中心，北京100094）

液相色譜-串聯質譜法同時測定嬰幼兒配方奶粉中12種水溶性維生素

耿健強，趙麗，潘紅艷，邵明媛，王浩

（國家食品質量安全監督檢驗中心，北京市食品安全監控和風險評估中心，北京100094）

建立了同時測定嬰幼兒配方奶粉中多種維生素、牛磺酸等12種水溶性維生素的液相色譜串聯質譜測定法。采用MGⅢ-C18色譜柱，以質量分數為0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動相（梯度洗脫），流速為0.25 mL/min，柱溫25℃，進樣量5 μL。方法檢出限0.0001～1 mg/kg，高、中、低不同質量分數加標回收率85.0%～95.5%，相對標準偏差為2.9%～9.1%。該法具有樣品預處理簡單,靈敏度高,分析時間短等優點,適用于嬰幼兒配方奶粉中上述12種水溶性維生素的同時測定。

高效液相色譜儀；嬰幼兒配方奶粉；水溶性維生素

0 引 言

水溶性維生素是嬰兒配方奶粉的重要組成部分，在人體生長、代謝、發育過程中發揮著重要的作用。目前我國國標只能對單一或兩三種水溶性維生素進行檢測，其中，牛磺酸、VB1、VB2、VB3、VB6主要用高效液相測定；VB5、VB9、VH和VB12主要用微生物法測定。這些方法前處理繁瑣，檢測周期長，成本高，不能滿足多種物質快速同時檢測的要求。本文采用液質聯用法同時對嬰幼兒配方乳粉中12種水溶性維生素測定，定量采用了作者獨創的測定液標準溶液加入定量法，克服了液質法定量中經常存在的基質效應，該方法準確、靈敏，適用于大批量樣品的快速檢測。

1 實 驗

1.1 儀器與設備

Agilent 6410型串聯三重四極桿質譜儀，配Agi?lent1200型液相色譜儀，KQ-5200型超聲波清洗儀，Milli-Q去離子水發生器。

1.2 試劑與材料

甲醇，乙腈，鹽酸，氫氧化鈉，氨水，以上均為分析純。

VB1，VB2，VB3，VB5，VB6，VB9(葉酸)，VB12，VH，牛磺酸。

樣品購自本地超市。

1.3 方法

標準儲備液的配制：分別稱取適量的煙酸和煙酰胺標準品，分別用超純水配成2.5 mg/mL的標準儲備液。稱取適量的泛酸標準品，用超純水配成1.0 mg/mL標準儲備液。稱取適量的維生素B1(硫胺素)標準品用濃度為0.01 mol/L鹽酸溶液溶解后，用超純水配成質量濃度為0.5 g/L標準儲備液。稱取適量的VB2(核黃素)標準品，用濃度為2 mol/L鹽酸溶液溶解后，用超純水配成質量濃度為0.5 g/L標準儲備液。稱取適量的葉酸標準品，用適量水潤濕，加入質量分數為10%氨水溶液至完全溶解后，用超純水配成質量濃度為0.1 g/L標準儲備液。分別稱取適量的吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺，VB12和生物素標準品，分別用超純水配成質量濃度為1.0 g/L標準儲備液。稱取適量的牛磺酸標準品，用超純水配成質量濃度為10.0 g/L標準儲備液。

標準工作溶液的配制：分別吸取上述適量的標準儲備液于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成煙酸、煙酰胺、泛酸、VB1、VB2、吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺、VB9(葉酸)、VB12(氰鈷胺)、VH（生物素）、牛磺酸質量濃度為 250，250，200，25，50，25，25，25，5，0.25，1.5，1 500 g/mL標準工作溶液

1.4 色譜條件

色譜柱：資生堂 MGⅢ-C18柱，5 μm，2.0 mm×150 mm。

條件：流速0.25 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量5μL，流動相：0.1%甲酸水溶液（A）+甲醇（B）。 梯度洗脫：0～5 min,B 由5%線性遞增至95%，5～10 min，B保持95%，10.0～10.1 min，B由95%線性遞減至5%，10.1～15.0 min，B保持5%。

1.5 質譜分析條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正離子模式（牛磺酸為負離子模式）；檢測方式為多反應檢測；干燥氣為N2；霧化氣壓力為275.8 kPa；干燥氣流速為8 L/min；汽化溫度為340℃；其質譜參數和保留時間如表1所示。

表1 質譜參數和保留時間

1.6 樣品處理

準確稱取5 g樣品，用25.0 mL（50℃）熱水溶解，超聲10 min，用濃度為5 mol/L鹽酸溶液調節pH值至1.7，放置2 min后，再用濃度為2.5 mol/L氫氧化鈉溶液調節其pH值至4.5。將樣品溶液移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度后，倒入漏斗用快速定性濾紙自然過濾，棄去最初濾液，在50 mL錐形瓶中收集濾液，并充分混勻，濾液過0.22 m有機濾膜，待測。

1.7 定性定量方法

采用標準物質的保留時間及定性定量離子對比例對樣品峰進行準確定性；因為奶粉樣品基質復雜，如果用純標定量，基質效應較大，所以本方法根據樣品的標示值，在1.5 mL進樣瓶中用標準工作溶液對測定液依次配制不同濃度的樣品標準溶液進樣分析,以質量濃度(μg/mL)為橫坐標,以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，通過比較測定液和加標溶液目標化合物的差值，計算出測定液中12種水溶性維生素的含量。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件選擇

水溶性維生素易溶于水，不溶于脂肪和有機溶劑，易分解。根據這12種水溶性維生素的化學特性，本研究先采用50℃熱水充分溶解乳粉，超聲提取10 min，為了充分破壞樣品中的蛋白質，再加入酸溶液調節pH值至1.7，放置2 min后，再用2.5 mol/L氫氧化鈉溶液調節其pH值至4.5。經過反復試驗，這種前處理的方法簡便快速，加標回收率高（平均加標回收率＞85%），可以滿足方法學檢測要求。

2.2 色譜條件的優化

色譜柱的選擇：為了有利于色譜峰的分離及鋒形的改善，本方法分別采用資生堂MGⅢ-C18色譜柱(150 mm × 2.0 mm,5 μm)、ZORBAX Eclipse XDB-C1 8色譜柱和ZORBAX SB-Aq色譜柱(150 mm×2.1 mm,3.5 μm）進行分離試驗，發現資生堂MGⅢ-C18色譜柱(150 mm × 2.0 mm,5 μm)效果較好。

流動相的選擇：煙酸、煙酰胺、牛磺酸、VB1、VB6（包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺）屬于強極性化合物，在反相C8柱上保留較弱，而泛酸、葉酸、VB12、生物素為中等極性化合物，為了有利于色譜峰的分離及峰形的改善，本方法采用0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動相，利用梯度洗脫的方法提高分離效果，測試開始時，流動相中0.1%甲酸水溶液-甲醇的比例為95∶5，然后在0～5 min改變二者的比例為5∶95，這一部分主要是洗脫測定液中煙酸等極性較強的目標化合物，5～10 min內保持此比例，這一部分主要是洗脫測定液中的中這一部分主要是洗脫測定液中泛酸等中等極性目標化合物。通過上述兩步梯度，在10 min內，可以較好的分離測定液中12種水溶性維生素（煙酸、煙酰胺、泛酸、VB1、VB2、吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺、葉酸、VB12、生物素、牛磺酸）（結果如表1所示）。

2.3 質譜條件的優化

采用直接進樣方式分別將質量濃度為1 μg/mL的12種水溶性維生素（煙酸、煙酰胺、泛酸、VB1、VB2、吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺、葉酸、VB12、生物素、牛磺酸）分別注入離子源中，在正離子（牛磺酸為負離子）檢測方式下進行母離子全掃描，得到12種水溶性維生素的分子離子峰。根據歐盟2002/657/EC指令規定對于質譜確證方法必須達到4個確證點的要求,低分辨液相色譜-質譜聯用儀檢測應在確定母離子的基礎上選擇兩個以上的子離子。分別以該離子峰為母離子，進行二級質譜掃描，最后采集全掃描的二級質譜圖，得到碎片離子信息，然后再對得到的二級質譜參數如破碎電壓、碰撞能量等進行優化，使定性離子與定量離子產生的離子對強度比例達到最大時為最佳。最終得到12種水溶性維生素的最佳質譜參數，結果如表1所示。

2.4 標準曲線線性范圍

將樣品加標溶液分別進樣5 μL，測定結果經線性回歸。線性范圍：煙酸、煙酰胺為 0.2 ～10.0 μg/mL, 泛酸為 0.1～7.5 μg/mL，維生素B1為0.1～1.0 μg/mL；維生素B2為0.1～2.0 μg/mL、吡醛醛、吡哆醇、吡哆胺為0.05～1 μg/mL；葉酸為0.1～10 ng/mL；維生素B12為0.1～10.0 ng/mL；生物素為5～50 ng/mL；牛磺酸為1～50 μg/mL。回歸方程（y為峰面積；x為質量濃度，μg/mL）相關系數和檢出限如表2所示。

2.5 方法的回收率和精密度

稱取已知含量的同一樣品6份,每份5.00 g,分別添加三個濃度的標準品,按供試品制備方法處理后,進行測定,結果如表3所示。從表中可看出,樣品加標回收率85.0%～95.5%,平均相對標準偏差為2.9%～9.1%（n=6）。

2.6 實際樣品的測定

表2 12種水溶性維生素的回歸方程、相關系數及檢出限

運用本方法對市場購買的5種品牌的嬰幼兒配方奶粉進行檢測，測定結果見表4。維生素實際測定含量與標示值相符，均符合我國食品安全國家標準GB 10765-2010《嬰幼兒配方食品》和GB 10767-2010《較大嬰幼兒配方食品》。

表3 樣品中12種水溶性維生素的的回收率與相對標準偏差

（續表3）

3 結 論

本文建立了液相色譜串聯三重四級桿質譜同時測定嬰幼兒配方奶粉中煙酸、煙酰胺、泛酸、VB1、VB2、吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺、葉酸、VB12、生物素、牛磺酸的快速定性定量方法。該法分析時間小于10 min，其線性關系良好（r＞0.999）,檢出限在 0.0001～1 mg/kg之間。在3個水平添加回收率試驗，每個水平重復6次，其平均回收率在85.0%～95.5%之間，測定結果的相對標準偏差小于10%。該方法快速準確，可靠，并且靈敏度高，有望應用于嬰幼兒配方奶粉中水溶性維生素含量的同步定性定量測定。

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表4 檢測結果 μg/100g

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Study on simultaneous detection of 12 Water-soluble Vitamins in infant milk powder by HPLC-MS

GENG Jianqiang,ZHAO Li,PAN Hongyan,SHAO Mingyuan,WANG Hao

(Nation Food Quality&Safety Supervision and Inspection Center,Beijing 100094，China)

This thesis developed a method for simultaneous determination of 12 Water-soluble Vitamins in infant milk powder by HPLC-MS.The chromatography was performed using a MGⅢ-C18 column(150 mm × 2.0 mm,5 μm),with a mobile phase consisting of 0.1%formic acid–methanol solution by gradient elution,the flow was 0.25 mL/min,the column temperature was 25℃,and the injection volume was 5 μL.The limits of quantitation were between 0.0001 mg/kg and 1 mg/kg.Overall recoveries of high,medium and low concen?trations were between 85.0%and 95.5%,and RSD(n=6)value were between 2.9%and 9.1%.The results showed that the method was sensi?tive,accurate,convenient and quick,which can be used to detect simultaneously the 12 water-soluble Vitamins in infant milk powder.

HPLC-MS；infant milk powder；Water-soluble Vitamins

TS252.7

A

1001-2230（2017）08-0043-04

2017-02-17

耿健強（1977-），男，高級工程師，研究方向為食品安全監管。

趙麗