纖維素降解菌的篩選與復(fù)合菌群的構(gòu)建

潘林 胡影 于天雁 王志剛

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.061[HT9.]

摘要：堆肥中的纖維素是制約堆肥進(jìn)程的關(guān)鍵。通過對樣品進(jìn)行常溫和高溫多代馴化，獲得4株高效纖維素降解菌，其中2株常溫菌Bacillus amyloliquefaciens LZN01、Bacillus amyloliquefaciens LZN02，2株高溫菌Bacillus licheniformis LZN03、Bacillus licheniformis MLY0。4株菌對濾紙均有降解能力，且常溫菌復(fù)合菌系的濾紙崩解能力、濾紙酶活性與CMC酶活性分別為10.81%、0.17 U/mL與7.41 U/mL，高溫菌復(fù)合菌系分別為5.69%、0.10 U/mL與12.69 U/mL。4株菌間不存在拮抗效應(yīng)，多數(shù)能夠交叉生長，能夠構(gòu)建成為復(fù)合菌群。因此，這4株菌在構(gòu)建纖維素復(fù)合菌群并應(yīng)用到堆肥體系中具有一定的前景。

關(guān)鍵詞：纖維素；降解菌；復(fù)合菌群；堆肥

中圖分類號： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0229-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-03-18

基金項(xiàng)目：黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃（編號：UNPYSCT-2015092）。

作者簡介：潘林（1964—），男，黑龍江齊齊哈爾人，碩士，副教授，主要從事生物學(xué)方面的教學(xué)與研究工作。Tel：（0452）2738361；E-mail：plin@163.com。

通信作者：王志剛，博士，副教授，主要從事微生物學(xué)方面的教學(xué)與研究工作。Tel：（0452）2738781；E-mail：wzg1980830@sina.com。[HJ]

[ZK）]

堆肥是畜禽廢棄物無害化、資源化的有效手段，但其中高含量的纖維素是制約堆肥進(jìn)程的關(guān)鍵[1]，在堆肥過程中接種纖維素降解菌，可以有效促進(jìn)纖維素的分解，加速堆肥腐熟，并提高堆肥的品質(zhì)[2]。但單一菌株在堆肥中可發(fā)揮的作用有限，篩選高效纖維素降解菌株并構(gòu)建高效的堆肥菌系，是處理畜禽廢棄物的有效手段。構(gòu)建不同功能的復(fù)合菌系可加速堆肥發(fā)酵進(jìn)程，因而受到廣泛關(guān)注[3-4]。因此，本試驗(yàn)從腐殖土和堆肥樣品中分離篩選高效纖維素降解菌株，并構(gòu)建高效功能性復(fù)合菌系，為堆肥腐熟劑的研發(fā)提供參考。

[BT1#]1材料與方法

1.1試劑及儀器

試劑：羧甲基纖維素鈉購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器：T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；D-37520離心機(jī)（德國）；100-230V純水系統(tǒng)（MILLPORE）。

1.2培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：CMC-Na 20 g，Na2HPO4 2.5 g，KH2PO4 1.5 g，蛋白胨2.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至 1 000 mL。

剛果紅培養(yǎng)基：K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，CMC-Na 1.88 g，剛果紅0.2 g，明膠2 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

濾紙條培養(yǎng)基：KH2PO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，NaNO3 2.5 g，MgSO4 0.3 g，F(xiàn)eCl3 0.01 g，CaCl2 0.1 g，濾紙條（1 cm×6 cm）3條/三角瓶，蒸餾水定容至1 000 mL。

液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 7.5 g，大豆粉7.5 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4·.7H2O 0.25 g，KH2PO4 4 g，濾紙2.5 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃，滅菌20 min。

1.3樣品來源

從扎龍自然保護(hù)區(qū)采集的腐殖土和黑龍江田雨綠色農(nóng)業(yè)工程有限公司的雞糞堆肥中取樣，并進(jìn)行常溫（30 ℃）及高溫（50 ℃）多代馴化，篩選常溫、高溫菌。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1菌株的篩選與純化

取5 g馴化后的樣品與水按 1 ∶[KG-*3]10 比例混合，130 r/min振蕩10 min，靜置。取上清液稀釋涂布于剛果紅培養(yǎng)基上，常溫菌置于30 ℃下培養(yǎng)；高溫樣品于50 ℃水浴30 min后，取上清液進(jìn)行稀釋涂布，50 ℃培養(yǎng)。挑取透明圈清晰的菌株進(jìn)行分離純化，將所得到的菌株接入濾紙條培養(yǎng)基中驗(yàn)證其對濾紙的分解情況。

1.4.2濾紙崩解試驗(yàn)

設(shè)置單一菌株試驗(yàn)組、常溫混合菌與高溫混合菌試驗(yàn)組，將各菌株組合的菌液按2%比例接入液體選擇培養(yǎng)基中，將各菌液按照2%比例接種于100 mL濾紙條培養(yǎng)基中，常溫菌30 ℃、130 r/min條件下振蕩培養(yǎng)；高溫菌50 ℃、130 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)2、4、6、8、10 d 測定濾紙崩解情況。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.5拮抗試驗(yàn)

采用劃線法將篩選出的纖維素降解菌在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上進(jìn)行畫線，各線之間不相交，30 ℃培養(yǎng)24 h后觀察各菌株之間的拮抗作用。

1.6不同菌株組合粗酶液制備與酶活性測定

設(shè)置單一菌株試驗(yàn)組、常溫混合菌與高溫混合菌試驗(yàn)組，將各菌株組合的菌液按2%比例接入液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，130 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔24 h取培養(yǎng)液2 mL，4 ℃，8 000 r/min 離心20 min，上清液作為粗酶液，采用3，5-二硝基水楊酸法[5]（DNS）測定酶液中還原糖含量，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線后測定濾紙酶（FPase）活性與羧甲基纖維素酶（CMCase）活性，酶活性單位參照國際單位規(guī)定定義，即在1 mL體系中，1 min 內(nèi)催化纖維素水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活性單位（U/mL）。endprint

1.7菌株鑒定

采用形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rDNA序列比對進(jìn)行綜合鑒定，由上海美吉生物公司測序，測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行比對，用MEGA 4.0軟件進(jìn)行序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析，并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.8數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與圖表制作。

2結(jié)果與分析

2.1菌株分離純化與功能的初步鑒定

分離純化得到4株纖維素降解能力較強(qiáng)的菌株，包含2株常溫菌株（LZN01、LZN02）與2株高溫菌株（LZN03、MLY01）。LZN01菌落為乳白色偏黃、圓形，邊緣不規(guī)則，表面褶皺隆起，革蘭氏陽性，桿狀，可形成芽孢；LZN02菌落形態(tài)為白色，表面呈緊密狀，干燥，革蘭氏陽性，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密不易挑取；LZN03、MLY01菌落為乳白色偏黃，LZN03菌落圓形，革蘭氏陽性，細(xì)桿狀；MLY01菌落扁平、邊緣不整齊呈須根狀，表面粗糙褶皺，革蘭氏陽性，細(xì)長桿狀。從表1可知，透明圈直徑與菌落直徑比值表現(xiàn)為LZN01>MLY01>LZN03>LZN02。透明圈直徑與菌落直徑的比值大小可以初步判定纖維素降解菌降解能力的大小，原則上其比值越大，對纖維素的降解能力越強(qiáng)。

2.2菌株16S rDNA鑒定

通過16S rDNA測序和系統(tǒng)進(jìn)化樹的同源性進(jìn)行比較分析（圖1）可知，LZN01與LZN02同為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)，鑒定結(jié)果不是同一菌株；而LZN03與MLY01為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），親緣關(guān)系較近，形態(tài)學(xué)與鏡檢結(jié)果不同，初步鑒定2株菌并非同一菌株。

2.3濾紙條崩解試驗(yàn)

由圖2可知，4株菌對濾紙均有一定的降解能力，其中常溫菌LZN02的降解能力較強(qiáng)，培養(yǎng)10 d時(shí)可降解19.11%的濾紙，而復(fù)合菌系可降解10.81%的濾紙；耐高溫菌復(fù)合菌系降解10 d時(shí)可降解5.69%的濾紙。高溫復(fù)合菌系的濾紙崩解能力高于單一菌株，說明構(gòu)建高溫菌復(fù)合菌系可以提高菌系的濾紙降解能力，而常溫菌復(fù)合菌系的濾紙降解率低于單一菌株LZN02。

2.4常溫菌濾紙酶活性與CMC酶活性

濾紙酶活性大致可以反映纖維素酶的3種酶（C1酶、Cx酶與葡萄糖糖苷酶）之間的協(xié)同作用，而CMC酶活性則僅反映纖維素酶內(nèi)切β-1，4-葡聚糖的活性，酶液與底物CMC-Na的結(jié)合較強(qiáng)，故CMC酶活性遠(yuǎn)大于濾紙酶活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，復(fù)合菌系的濾紙酶活與CMC酶活大多高于單一菌株，復(fù)合菌系在培養(yǎng)6 d時(shí)有最大濾紙酶活性（0.17 U/mL） 與CMC酶活性（7.41 U/mL），但與LZN02相比，酶活增加不明顯，也進(jìn)一步證實(shí)LZN02可能與LZN01存在空間或營養(yǎng)的競爭（圖3）。

2.5高溫菌濾紙酶活性與CMC酶活性

由圖4可知，復(fù)合菌系的濾紙酶活性在培養(yǎng)5 d達(dá)到最大（0.10 U/mL），酶活力稍高于單一菌株；而復(fù)合菌系的CMC酶活與單一菌株相比，變化幅度較大，在培養(yǎng)4 d達(dá)到最大（12.70 U/mL）。CMC酶活性變化大，說明復(fù)合菌系內(nèi)切 β-1，4-葡聚糖的活性較強(qiáng)，并且與常溫組相比，高溫組2株菌均為細(xì)菌，生長速度較快且2株菌之間存在協(xié)同作用。

2.6菌株間的拮抗作用

由表2可看出，LZN01與LZN03、MLY01間無明顯的拮抗作用，但不能交叉生長；LZN02與LZN01、LZN03和MLY01無拮抗可以交叉生長；LZN03和MLY01無拮抗可以交叉生長。常溫菌株的最適生長溫度為35 ℃，高溫菌株的最適生長溫度為45 ℃，結(jié)合堆肥過程中溫度的變化特征，這4株菌完全具備構(gòu)建符合菌群的條件。

3討論

本試驗(yàn)通過對樣品進(jìn)行常溫和高溫多代馴化，得到4株高效纖維素降解菌，包括常溫菌B. amyloliquefaciens LZN01、B. amyloliquefaciens LZN02，高溫菌B. licheniformis LZN03、B. licheniformis MLY01。解淀粉芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌是重要的生防微生物資源[6]，芽孢桿菌在自然界中的分布十分廣泛，可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)且對人畜無害，對環(huán)境友好，因而備受國內(nèi)外植物與環(huán)境專家的關(guān)注[7]。Bacillus amyloliquefaciens已在美國作為殺菌劑進(jìn)行了登記， 用于防治土傳的絲核菌和鐮刀菌；可促進(jìn)植物生長，并作為植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行了登記；我國利用枯草芽孢桿菌防治植物病害的應(yīng)用研究也達(dá)到了世界先進(jìn)水平，現(xiàn)已開發(fā)出一批生防作用優(yōu)良的枯草芽孢桿菌菌株；芽孢桿菌因具有芽孢，因此同時(shí)具有耐高溫、耐酸堿等特性，在堆肥的整個(gè)時(shí)期內(nèi)均為優(yōu)勢菌群，起著重要作用，并且芽孢桿菌也對堆體的升溫有促進(jìn)作用[8]。

分別對篩選得到的4株菌進(jìn)行濾紙降解能力以及酶活性的測定，結(jié)果顯示，供試菌株對濾紙有一定的降解能力，其中LZN02的降解能力最強(qiáng)。單一的細(xì)菌、真菌和放線菌盡管活性較高，但在加速堆肥化進(jìn)程中的效果卻不如復(fù)合微生物菌群的共同作用明顯，自然界中木質(zhì)素、纖維素的降解是真菌、細(xì)菌及相應(yīng)微生物群落共同作用的結(jié)果[9]，因而復(fù)合菌系具有更高的應(yīng)用價(jià)值。而酶活性測定結(jié)果顯示，無論是常溫復(fù)合菌系還是高溫復(fù)合菌系，其CMC酶活性與單一菌株相比，變化幅度較大，而濾紙酶活性的增加則不明顯，說明微生物對不同底物的降解能力和適應(yīng)性存在差異，并且細(xì)菌和真菌降解纖維素的機(jī)理不同，真菌主要靠分泌多種胞外酶對纖維素進(jìn)行降解，而大多數(shù)細(xì)菌的纖維素降解則是通過細(xì)胞胞外酶進(jìn)行的，須要附著在纖維素表面上才能將其降解[10]。崔宗均等利用酸堿互補(bǔ)的原則馴化得到高效復(fù)合菌系MC1[11]。崔詩法等從枯枝落葉中分離到1組由平板可分離細(xì)菌和難培養(yǎng)細(xì)菌組成的纖維素分解復(fù)合菌系St-13[12]。本試驗(yàn)通過常溫以及高溫的多代馴化，得到的菌株更符合堆肥不同階段溫度特性，并且4株菌也是堆肥體系各時(shí)期均可存在的優(yōu)勢菌株，因此應(yīng)用更為廣泛。同時(shí)，本研究所構(gòu)建的復(fù)合菌系只有4株菌組成，生產(chǎn)工序簡單，質(zhì)量容易控制，且均為環(huán)境友好型菌株，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中操作性強(qiáng)，應(yīng)用價(jià)值較高。endprint

4結(jié)論

本試驗(yàn)通過對樣品進(jìn)行常溫和高溫多代馴化，得到4株高效纖維素降解菌，常溫菌（LZN01、LZN02）為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），高溫菌（LZN03、MLY01）為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。高溫菌復(fù)合菌系的濾紙崩解能力在培養(yǎng)5 d時(shí)高于單一菌株，且各菌株間不存在拮抗效應(yīng)，因此，這幾株菌在構(gòu)建纖維素復(fù)合菌群方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

[HS2]參考文獻(xiàn)：[HJ1.72mm]

[1][ZK（#]曹云，常志州，黃紅英，等. 畜禽糞便堆肥前期理化及微生物性狀研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2015，34（11）：2198-2207.

[2]黃翠，楊朝暉，肖勇，等. 堆肥嗜熱纖維素分解菌的篩選鑒定及其強(qiáng)化堆肥研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（12）：2457-2463.

[3]Narisawa N，Haruta S，Cui Z J，et al. Effect of adding cellulolytic bacterium on stable cellulose-degrading microbial community[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2007，104（5）：432-434.

[4]徐智，張隴利，張發(fā)寶，等. 接種內(nèi)外源微生物菌劑對堆肥效果的影響[J]. 中國環(huán)境科學(xué)，2009，29（8）：856-860.

[5]王志剛，徐偉慧，厲悅，等. 纖維素降解菌協(xié)同效應(yīng)與粗酶液影響因素[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24（2）：279-283.

[6]顧文杰. 禽糞好氧堆肥除臭菌篩選及其促腐熟效果研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[7]陳志誼，劉永峰，劉郵洲，等. 植物病害生防芽孢桿菌研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（5）：999-1006.

[8]易境. 豬場廢棄物堆肥中芽孢桿菌和梭菌屬細(xì)菌的分子生態(tài)學(xué)研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[9]黃丹蓮. 堆肥微生物群落演替及木質(zhì)素降解功能微生物強(qiáng)化堆肥機(jī)理研究[D]. 長沙：湖南大學(xué)，2011.[ZK）]

[10][ZK（#]陳麗莉. 纖維素酶生產(chǎn)菌的選育及纖維素降解特性的研究[D]. 長春：長春理工大學(xué)，2008.

[11]崔宗均，李美丹，樸哲，等. 一組高效穩(wěn)定纖維素分解菌復(fù)合系MCI的篩選及功能[J]. 環(huán)境科學(xué)，2002，23（3）：36-39.

[12]崔詩法，廖銀章，黎云祥，等. 纖維素分解復(fù)合菌系St-13的篩選及產(chǎn)酶條件的研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，16（1）：8-11.endprint