調控CD163基因表達的miRNA鑒定及其在PRRSV感染中的作用分析

吳俊靜+喬木+武華玉+彭先文+梅書棋

摘要：豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染引起的一種危害大、控制難的豬傳染性疾病。PRRSV必須通過特異性受體誘導才能入侵宿主細胞，而CD163就是其中一個關鍵受體。在獲得靶向作用CD163基因miRNA的基礎上，進一步研究發現過表達miR-181c、miR-4262可極顯著抑制細胞內[WTBX][STBX]CD163mRNA的表達（P<0.01）；且在Marc-145細胞中證實miR-181c、miR-23b、miR-4262均具有極顯著抑制PRRSV增殖的功能（P<0.01），其中miR-4262抑制效果最佳。3個miRNA抗PRRSV增殖的分子機制比較復雜，miR-181c、miR-4262 可通過靶向抑制受體[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]發揮抗PRRSV增殖作用，而miR-23b是通過其他途徑發揮作用。并首次發現miR-4262具有抑制PRRSV增殖的作用，但其具體的分子作用機制還有待進一步深入研究。

關鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）；[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因；miRNA；抗病

中圖分類號： S858.285.3文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0016-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-03-18

基金項目：國家自然科學基金（編號：31501924）；湖北省自然科學基金（編號：2015CFA105）；湖北省技術創新重大項目（編號：2016ABA117）；湖北省科技支撐計劃（編號：2014BBB010）；湖北省農業科技創新中心創新團隊項目（編號：2016-620-000-001-022）；湖北省農業科學院競爭性計劃項目（編號：2016jzxjh029）。

作者簡介：吳俊靜（1984—），女，湖北武漢人，博士，助理研究員，主要從事豬遺傳育種研究。Tel：（027）87389516；E-mail：jeanne1106@126.com。

通信作者：梅書棋，碩士，研究員，主要從事豬遺傳育種研究。E-mail：msqlfe@163.com。

[ZK）]

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染引起的一種危害極大的傳染性免疫抑制性疾病，以妊娠母豬的繁殖障礙（流產、死胎、木乃伊胎）及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾病為特征。1987年豬繁殖與呼吸綜合征首次在美國暴發，幾年之內PRRS便席卷了北美洲、歐洲、亞太地區，至今仍在世界范圍內流行。特別是近年來由高致病性PRRSV引起的突發疫情高熱病在我國很多省份暴發和流行，仔豬致死率高，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失[1]。由于PRRSV具有變異快且復雜、免疫抑制、存在抗體依賴性增強作用等特征，目前采用疫苗等手段未能取得滿意的效果，防治PRRS仍然是養豬業的重大難題之一。

PRRSV有一個典型的生物學特征就是具有嚴格的宿主和細胞嗜性，它只感染豬，不感染其他物種，且主要感染單核巨噬細胞系中分化完全的細胞，尤其是豬肺泡巨噬細胞（porcine alveolar macrophages，PAM）。在體外，PRRSV可在PAM和猴腎細胞系及其衍生細胞系（Marc-145、MA-104等）中增殖。宿主細胞膜上的一些特異性受體的存在與否決定了該細胞對PRRSV的易感性，而[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]就是PRRSV感染宿主細胞的最關鍵受體之一，它參與介導病毒的內吞和增殖[2]。例如，在PRRSV非易感細胞系（BHK-21、PK-15、NLFK）中轉染[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]真核表達質粒可以使這些細胞系感染PRRSV并在細胞內產生子代病毒粒子[3-4]。采用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的抗體處理PAM可以有效阻止PRRSV的感染[3]，且永生化的PAM細胞系因無法正常表達[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]而變為PRRSV非易感細胞[5]。不僅如此，[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的表達量與PRRSV復制效率呈正相關，上調[WTBX][STBX]CD163表達會增加病毒增殖，而下調CD163[WTBZ][STBZ]表達可降低病毒增殖[6]。

MicroRNA（miRNA）是一類長約22個堿基、高度保守的內源性非編碼RNA分子，能夠互補或部分互補地與靶mRNA結合，使mRNA降解或介導其翻譯抑制，作為重要的轉錄后調節因子調控基因的表達[7]，miRNA幾乎參與調控了各個領域的所有細胞生命活動的發生，在哺乳動物中可能負責調控約50%的編碼基因[8]。在病毒感染和宿主天然免疫中，miRNA 也發揮著重要作用，參與病毒與宿主的互作，一方面，宿主miRNA可以作用于病毒基因組RNA抑制病毒增殖[5，9]，另一方面，病毒釋放的miRNA可作用于宿主基因抑制天然免疫[10-11]。

在前期工作中，筆者利用雙熒光素酶報告系統篩選獲得了3個可靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因3′非翻譯區的miRNA，分別為 miR-181、miR-23、miR-4262[12]，本研究將進一步分析其對[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因表達調控效應及對PRRSV感染增殖的抑制效果，為進一步獲得抗PRRSV增殖的功能miRNA奠定基礎。

1材料與方法

[HTK]1.1細胞和病毒[HT]

Marc-145細胞系，來源于華中農業大學，用含10%胎牛血清的DMEM培養基（購自HyClone）于5% CO2、37 ℃培養箱中培養。PRRSV-WUH3毒株，由華中農業大學分離保存，用于細胞感染試驗。endprint

1.2miRNA模擬物和抑制物

miRNA模擬物由上海吉瑪制藥技術有限公司人工合成，其序列如表1所示。

1.3miRNA模擬物轉染和PRRSV感染

轉染24 h前，消化Marc-145細胞，并通過細胞計數板對細胞懸浮液進行計數，以1×105個/孔細胞進行均勻地鋪板，細胞長滿80%的計數板時開始轉染。各miRNA模擬物按一定濃度（20、50、60、100 nmol/L）稀釋后與脂質體Lipofectamine 2000（購自Invitrogen）共孵育制備混合液，將混合液加入細胞培養基中，然后在5% CO2、37 ℃條件下培養24 h后收集細胞或細胞上清液，進行病毒感染。同時設置各種對照，Mock組為轉染空白對照組，僅加入了轉染試劑處理細胞，為轉染miRNA模擬物；NC組為miR-NC模擬物陰性對照組；NTC組為病毒感染空白對照組，采用PBS處理細胞。

1.4PRRSV感染

接種病毒前，先將病毒原液置于冰上慢慢融化。Marc-145轉染24 h后，用PRRSV-WUH3感染細胞[感染復數（multiplicity of infection，MOI）為0.1]，感染24 h后收集細胞或細胞上清液。

1.5RNA提取及RT-PCR

細胞或細胞培養液總RNA采用Trizol（購自Invitrogen）提取。反轉錄采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（購自Thermo Scientific），熒光定量PCR采用SYBR Select Master Mix for CFX（購自Applied Biosystems）染料，相對定量PCR采用GAPDH基因做內參。病毒RNA的絕對定量，采用含有PRRSV病毒基因組片段（138 bp）的pMD-18T載體（購自TaKaRa）作為標準品制作標準曲線。每個試驗至少重復3次。定量PCR所用引物的詳細信息如表2所示。

1.6統計分析

[JP2]數據用“平均值±標準差”表示；采用Students t檢測統計數據，P<0.05、P<0.01分別表示差異達到顯著、極顯著水平。[JP]

2結果與分析

2.1調控[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA表達的miRNA驗證

在前期研究中發現miR-181、miR-23、miR-4262均可靶向與[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因的3′非翻譯區結合[12]，為了驗證這3個miRNA是否能調控[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因 mRNA表達，本研究通過轉染miR-181c、miR-23b、miR-4262的模擬物在細胞內過表達各miRNA，檢測[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA表達量的變化情況，進一步驗證候選miRNA對[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的靶向調控作用。由圖1可知，與轉染空白對照組相比，轉染不同濃度梯度（20、50、100 nmol/L）的miR-181c、miR-4262均可極顯著抑制[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ][JP2]基因 mRNA表達量（P<0.01），而只有轉染高濃度劑量（100 nmol/L）的miR-23b才能顯著抑制[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因的表達（P<0.05）。轉染各濃度梯度的陰性對照miR-NC組的[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因 mRNA表達水平與空白對照Mock組無顯著差異（P>0.05）。可見miR-181、miR-4262均可靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因抑制其mRNA表達，且miR-4262的抑制效果最佳。[JP][FL）]

[FK（W12][TPWJJ1.tif][FK）]

[FL（2K2]2.2miRNA抑制病毒增殖的效應檢測

[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]是PRRSV感染宿主細胞的關鍵受體，而miR-181、miR-4262又可在一定程度上抑制[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因表達，因此，進一步在Marc-145細胞中檢測了miRNA抑制病毒增殖的效應。細胞轉染60 nmol/L的各miRNA模擬物24 h后，再用PRRSV感染（MOI=0.1），感染24 h后分別檢測細胞內和細胞培養液中PRRSV RNA的含量。由圖2、圖3可知，與轉染陰性對照NC組相比，轉染miR-181c、miR-23b、miR-4262均能極顯著地抑制細胞內和細胞培養液中的PRRSV RNA含量（P<0.01），其中miR-4262的抑制效果最好，可使細胞內病毒含量下降87%。

3討論與結論

研究表明，miRNA在病毒與宿主的互作中扮演著重要的

[FK（W11][TPWJJ2.tif][FK）]

[FK（W11][TPWJJ3.tif][FK）]

角色，它們可以靶向作用病毒入侵的細胞關鍵因子[13-14]，或是直接作用于病毒基因組[15-16]。鑒于PRRSV入侵靶細胞必須依賴宿主細胞的特異性受體表達這一典型生物學特性，從[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]這個關鍵受體入手，篩選鑒定獲得調控[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因表達的miRNA，從而找到抑制PRRSV感染增殖的功能miRNA。在前期的研究工作中，通過生物信息學預測和雙熒光素酶報告系統發現miR-181c、miR-23b、miR-4262均可靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因[12]，本研究進一步證實miR-181c、miR-23b、miR-4262均可顯著抑制PRRSV在細胞中復制增殖，但是這3個miRNA抗PRRSV增殖的分子機制可能不完全相同。endprint

2013年，Guo等首次發現miR-181可以直接作用于PRRSV基因組RNA，使病毒基因組降解發揮抗病毒效應[17]。同年，Gao等研究發現miR-181可以靶向作用受體基因[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的3′UTR，抑制受體基因[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]的表達，從而阻止PRRSV增殖[18]，本研究結果與之相符。但是，值得關注的一個問題是本研究發現miR-4262、miR-181c對[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA水平抑制效果相當（圖1），但是miR-4262對細胞內和細胞液中釋放的病毒含量的抑制效果卻顯著高于miR-181c（P<0.05），這暗示著這2個miRNA抑制PRRSV的分子機制并不完全相同。通過生物信息學預測分析發現，miR-4262 除了可靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因外，還能靶向調控另外一個PRRSV的關鍵受體基因[WTBX][STBX]CD169[WTBZ][STBZ]。miR-4262可能可以同時靶向作用[WTBX][STBX]CD163、CD169[WTBZ][STBZ]這2個PRRSV的關鍵受體基因，進而提高了阻斷PRRSV增殖的能力；另外一個原因可能是 miR-4262還參與調節天然免疫信號通路，促進Ⅰ型干擾素的表達，從而提高抗病毒增殖效應。在細胞中轉染 60 nmol/L 的miR-4262，同時用 5 μg/mL Poly（I ∶[KG-*3]C）（聚肌苷酸胞苷酸，購自InvivoGen公司）處理，15 h后用MOI=0.1劑量的PRRSV感染24 h，發現與轉染miR-NC對照組相比，過表達miR-4262可顯著上調Ⅰ型干擾素IFN-α、IFN-β的表達，說明miR-4262可一定程度解除PRRSV對Ⅰ型干擾素的抑制，然而具體分子機制還有待進一步深入研究。

轉染低濃度劑量（20、50 nmol/L）的miR-23b并不顯著抑制[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA的表達，即使是轉染100 nmol/L劑量的miR-23b也只能抑制11%的[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因mRNA表達量（圖1），然而miR-23b卻能大幅度抑制PRRSV在細胞內的復制與病毒的釋放（圖2、圖3）。因此，miR-23b的抗PRRSV增殖效應并不是通過抑制受體[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因實現的。Zhang等研究發現，PRRSV基因組RNA中含有miR-23b的作用靶點，表明miR-23b可能與PRRSV RNA靶向結合抑制病毒增殖[19]。同時，Zhang等還發現PRRSV感染后，miR-23 能通過激活IRF3/IRF7誘導產生Ⅰ型干擾素，進一步抑制病毒感染[19]。

PRRSV具有嚴格的細胞嗜性，入侵靶細胞依賴宿主細胞上特異性受體的表達，而[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]就是PRRSV入侵的一個關鍵受體基因。在獲得靶向作用[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]基因的miRNA的基礎上，進一步在細胞水平證實了miR-181c、miR-23b、miR-4262具有抑制PRRSV增殖的效應，其中miR-4262抑制效果最佳。3個miRNA抑制PRRSV增殖的分子機制不盡相同。miR-181c是同時通過靶向作用PRRSV基因組RNA和抑制PRRSV關鍵受體[WTBX][STBX]CD163[WTBZ][STBZ]發揮抗病毒作用；miR-4262是通過靶向抑制PRRSV關鍵受體[WTBX][STBX]CD163和CD169[WTBZ][STBZ]，同時參與誘導產生Ⅰ型干擾素抑制病毒增殖；miR-23b則可能是直接通過激活IRF3/IRF7誘導產生Ⅰ型干擾素抑制病毒感染。本研究首次發現miR-4262具有抑制PRRSV增殖的作用，其具體分子作用機制還有待更進一步的深入研究。

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