銀杏提取物聯合順鉑對人膠質瘤U251細胞增殖凋亡的影響

惠青山，吳芷芷，程琳

銀杏提取物聯合順鉑對人膠質瘤U251細胞增殖凋亡的影響

惠青山，吳芷芷，程琳

（濰坊護理職業學院，山東 青州 262500）

目的 研究銀杏提取物（GBE）聯合化療藥物順鉑對人腦膠質腫瘤細胞生長增殖和凋亡的影響。方法 正常培養傳代后的U251膠質瘤細胞按隨機分配的方法分為4組，A組僅加普通培養液，B、C、D組分別加銀杏提取物（200 mg/mL）0.5 mL、順鉑（1 mg/mL）0.01 mL、銀杏提取物（200 mg/mL）0.5 mL＋順鉑（1 mg/mL）0.01 mL；MTT法觀察U251細胞增殖情況，流式細胞儀檢測U251細胞凋亡率。結果 培養12、24、36、48、60 h，B、C、D組細胞增殖指數逐漸下降，與A組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；D組與B、C組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。將各組細胞培養24 h后上機，測得A組、B組、C組、D組腫瘤細胞的凋亡率分別為（0.6±0.3）%、（19.3±1.2）%、（38.9±3.5）%、（58.1±3.1）%。其中，B組、C組、D組分別與A組進行比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）；將D組與B組和C組進行比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論 銀杏提取物（GBE）聯合順鉑可抑制人腦膠質瘤U251細胞增殖，并誘導其凋亡。

銀杏提取物（GBE）；U251膠質瘤細胞；順鉑抗腫瘤藥物；凋亡

在腦腫瘤治療中，中成藥的輔助治療是一種重要的輔助手段，近年來，對銀杏提取物以及其制劑的研究不僅在治療心血管以及中樞神經系統的病變獲得突破[1-6]，在對腫瘤的治療上也備受關注。銀杏提取物是富含多種聚戊烯醇（GP）、銀杏黃酮、銀杏外種皮多糖等多種抗腫瘤成分[7-8]，具有顯著的對抗腫瘤生長特性并且具有輔助化學藥物治療的作用[9-11]。2017年1月我們進行了銀杏提取物（GBE）聯合順鉑對人膠質瘤細胞生長增殖和凋亡影響的實驗研究，研究內容如下。

1 材料與方法

1.1 材料 U251人膠質母細胞瘤細胞株，DMEM培養基，小牛血清蛋白，MTT試劑，順鉑藥物（藥物濃度為1 mg/mL），異硫氰酸熒光素—碘化丙染色試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏提取物（GBE）制備方法[12]將銀杏葉采用丙酮溶液提取后，除掉其脂溶、水溶性的物質成分和蛋白質、多聚糖等等一些高分子的化合物。

1.2.2 在顯微鏡下觀察染色后每組腫瘤細胞的形態特點。

1.2.3 U251腫瘤細胞的增殖生長和抑制情況觀察 把各分組細胞懸液的濃度調整為5×103/mL，接種96孔板，每孔1 mL，同時每組分別設置3個復孔。用緩沖溶液沖洗2遍后加入MTT試劑，然后在溫箱中繼續培養24 h后，采用酶聯免疫檢測儀測量570 nm波長下每組腫瘤細胞的光密度值（OD），來衡量細胞增殖和生長的情況。計算其抑制率。抑制率為1-實驗組吸光度/對照組吸光度。

1.2.4 U251腫瘤細胞的凋亡率計算 將培養24 h后的各組腫瘤細胞，進行異硫氰酸熒光素/碘化丙染色熒光染色；然后在流式細胞儀上檢測，按A、B、C、D組置孔，每組設置3個復孔，取得每組的3個數值，進行統計學分析，按“x±s”記錄得出的每組腫瘤細胞的凋亡率。

1.3 統計學方法 本研究數據均用SPSS19.0統計軟件處理，計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用例數（n）表示，計數資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 顯微鏡下觀察染色后各組U251腦膠質瘤細胞的形態特點 A組U251腫瘤細胞條索樣生長，細胞密度高；B組U251腫瘤細胞突起減少，腫瘤細胞數量也減少，且開始出現細胞空泡化現象；C組U251細胞邊界開始模糊，細胞空泡和顆粒較為明顯增多，出現許多凋亡小體：D組U251腫瘤細胞的數量明顯減少，出現明顯空泡化現象，并且有許多凋亡小體出現。見圖1～4。

圖1 空白組 Figure 1 blank group

圖2 銀杏提取物Figure 2 GBE group

圖3 順鉑組Figure 3 DDP group

圖4 聯合組Figure 4 GBE+DDP group

2.2 各組U251細胞生長和抑制情況 培養12、24、36、48、60 h，B、C、D組細胞增殖指數逐漸下降，與A組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）；D組與B、C組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。細胞的抑制率分別在培養12、24、36、48、60 h，均為A＜B＜C＜D。見表1、2。

2.3 各組U251細胞凋亡率的比較 將各組培養24 h后上機，測得A、B、C、D各組細胞的凋亡率分別為（0.3±0.2）%，（10.6±1.5）%，（35.9±2.8）%，（52.1±4.1）%。其中，B、C、D各組和A組進行比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）；將D組與B、C組兩組進行比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。U251細胞的凋亡率為A＜B＜C＜D，同時反映細胞被抑制程度為A＜B＜C＜D。

表1 各組U251細胞生長情況（x±s）Table 1 Growth of U251 cell after treated wth different drugs for different time(x±s)

表2 各組U251抑制率比較Table 2 Inhibition rate of U251 cell after treated wth different drugs for different time

3 討論

銀杏，孑遺植物。銀杏葉具有很高的藥用價值，主要以用于腦缺血、腦缺氧等臨床治療，而對其抗腫瘤的研究較少。近幾年，研究表明，銀杏提取物中的多種聚戊烯醇（GP）、銀杏黃酮、銀杏外種皮多糖化合物，含有具有顯著的抗腫瘤活性[13-16]。其可能作用機制涉及抑制腫瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡、調節機體免疫功能，調節細胞因子，誘導癌細胞分化和凋亡等[17-18]。本研究結果表明，銀杏提取物（GBE）對U251腫瘤細胞的生長抑制現象要比對照組明顯，并且凋亡率也明顯增高。

順鉑作為一類臨床常用的抗腫瘤藥物，也是臨床上較為有效的化療藥物之一，對多種腫瘤細胞的生長具有抑制能力，其中處于G期的腫瘤細胞最為敏感，僅應用順鉑就可以達到25%～50%的有效率，且少見有交叉耐藥的現象。本研究結果表明，銀杏提取物（GBE）聯合順鉑治療組較單獨分別治療的細胞抑制效果增強，而且細胞凋亡也增加。這表明，銀杏提取物（GBE）可提高腫瘤細胞對順鉑的敏感性，兩者有協同加強效果。其可能的原因是銀杏提取物中的GBEP能調節免疫機制，影響bax基因的表達，從而誘導腫瘤細胞凋亡有關[19-20]。另外，順鉑可通過對機體免疫功能的調整，對腫瘤抗原調變的雙重作用，從而增強銀杏提取物提取物（GBE）的抗腫瘤作用[21]。

綜上所述，銀杏提取物（GBE）聯合順鉑可抑制人腦膠質瘤U251細胞增殖，并誘導其凋亡，期望成為新型藥物，填補化療藥物輔助的空白。

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The effect of Ginkgo Biloba Extracts combined with cisplatin on proliferation and apoptosis of human glioblastoma U251 cells

Hui Qing-shan,Wu Zhi-zhi,Cheng Lin
(Weifang Nursing vocational College,Qingzhou,Shandong,262500,China)

Objective To observe the effect of Cisplatin combinated with the Ginkgo Biloba Extracts on proliferation and apoptosis of U251 glioma cells.Methods Divide the handed U251cellsintofourgroupsrandomly.Add nutrient solution to A,whileaddactivatedGinkgoBilobaExtracts(200 mg/mL)0.5 mL to B,cisplatin(1 mg/mL)0.01 mL to C,Ginkgo Biloba Extracts(200 mg/mL)0.5 mL and cisplatin(1 mg/mL)0.01 mL to D.Observe the proliferation rate of U251 by MTT and analysis the apoptosis of U251 cells by the flow cytometric.Results The index of cell proliferation of B、C、D goroup declined Gradually with the training of 12 h,24 h,36 h,48 h,60 h.Compared B,C,D with A,the difference was statistically significant(P＜0.05),and compared group D with B and C,the difference was statistically significant(P＜0.05).After the training of 24 h,the cell apoptosis rate of group A,B,C,D was(0.6±0.3)%,(19.3±1.2)%,(38.9±3.5)%,(58.1±3.1)%respectively.Compared B,C,D with A,the difference was statistically significant(P＜0.05),and compared group D with B and C,the difference was statistically significant(P＜0.05).Conclusion Ginkgo Biloba Extracts combined with cisplatin can restrain the proliferation of U251 glioma and also lead to the apoptosis of U251 cells.

Ginkgo Biloba Extracts;U251 Glioma cells;CisplatinAntineoplastic Drugs;Apoptosis

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.28.004