咪唑立賓對腎病綜合征大鼠足細胞損傷的影響

陶琳 劉冰

河南省人民醫院 腎內科 河南 鄭州 450003)

·論著·

咪唑立賓對腎病綜合征大鼠足細胞損傷的影響

陶琳 劉冰

河南省人民醫院 腎內科 河南 鄭州 450003)

目的探討咪唑立賓(MZR)對腎病綜合征大鼠足細胞損傷的影響。方法將36只雄性SD大鼠按照隨機數表法分為正常對照組(A組，12只)和模型組(24只)，對模型組大鼠采用尾靜脈注射阿霉素(6.5 mg/kg)的方法建立腎病綜合征大鼠模型，篩選出建模成功者并按照隨機數表法分為B組(腎病模型組)和C組(MZR干預組)，各10只。在注藥后8周末采用考馬斯亮藍法檢測各組大鼠24 h尿蛋白定量，蘇木素-伊紅(HE)染色評估腎小球形態結構，通過透射電鏡觀察腎臟足細胞形態。結果與A、C組相比，B組大鼠24 h尿蛋白定量較高，差異有統計學意義(P<0.05)，且B組大鼠腎臟足細胞損傷程度較A、C兩組重，細胞外基質沉淀聚集量較A、C兩組多。結論MZR能夠減輕腎病綜合征大鼠足細胞損傷程度，減少細胞外基質聚集，降低24 h尿蛋白定量，為臨床應用MZR治療腎病綜合征提供了依據。【

】 咪唑立賓；腎病綜合征；大鼠；足細胞；24 h尿蛋白定量

咪唑立賓(mizoribine，MZR)是一種新型免疫抑制劑，早期多用于預防和抑制腎移植的排斥反應，由于該藥能夠明顯改善患者蛋白尿癥狀，近年來臨床也將其用于兒童和成人難治性腎病綜合征等多種免疫相關性疾病的治療[1]。腎小球足細胞病變造成的腎小球濾過屏障受損，是部分腎病綜合征患者出現大量蛋白尿的重要原因[2]。MZR治療難治性腎病綜合征的機制是否與減輕足細胞損傷有關，目前尚缺乏相關研究。本實驗應用阿霉素制備腎病綜合征大鼠模型，旨在探討MZR對腎病綜合征大鼠足細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康清潔級雄性SD大鼠36只(鄭州大學實驗動物中心提供)，體質量為180～200 g，所有大鼠尿蛋白經檢測均為陰性。

1.2主要儀器與試劑注射用阿霉素(上海華聯制藥有限公司)，灌胃用MZR(日本旭化成制藥株式會社)，考馬斯亮藍試劑盒(南京建成生物制品公司)，光學顯微鏡(上海光學儀器廠)，JOLM100CX-Ⅱ型透射電鏡(日本電子公司)。

1.3實驗動物模型制備將36只大鼠按照隨機數表法分為正常對照組(A組，12只)和模型組(24只)。對模型組大鼠實施單次尾靜脈注射阿霉素(6.5 mg/kg)，對對照組大鼠注射等量生理鹽水。注射1周后，在代謝籠收集兩組大鼠24 h尿量并檢測尿蛋白，尿蛋白定量>100 mg/24 h即建模成功。最終共計20只大鼠建模成功，將建模成功的20只大鼠按照隨機數表法分為腎病模型組(B組)和MZR干預組(C組)，各10只。給予C組大鼠MZR，20 mg/kg，1次/d，灌胃，連續給藥8周；給予A、B兩組大鼠等量等時間蒸餾水灌胃。1.4大鼠24h尿蛋白定量檢測灌胃結束后，采用代謝籠收集3組大鼠24 h尿液，記錄尿量，并采用考馬斯亮藍法測定各組大鼠24 h尿蛋白定量。

1.5腎臟常規病理切片制作收集尿液后處死大鼠，將其腎組織切割成厚度為2 mm的小塊，常規石蠟包埋，行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，石蠟切片常規脫蠟至水，Harris蘇木素染色5 min，自來水沖洗1 min，1%鹽酸酒精分化4 s，水沖洗，飽和碳酸鋰顯藍，鏡下觀察細胞核呈藍色，伊紅染色1 min，脫水、透明、封片，普通光鏡觀察。

1.6腎臟病理學電鏡檢查取1 mm3大小的腎皮質浸于2.5%戊二醛，4 ℃冰箱固定4 h，1%鋨酸室溫固定2 h，梯度酒精-丙酮脫水，超薄切片，鉛鈾雙染。透射電鏡下觀察腎小球足細胞形態。

2 結果

2.1各組大鼠24h尿蛋白定量變化與B組相比，A、C兩組大鼠24 h尿蛋白定量均較低[A組(19.4±4.2)mg，B組(334.2±79.8)mg，C組(150.8±61.2)mg]，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.2各組大鼠腎臟HE染色結果A組大鼠腎臟HE染色可見腎小球形態基本正常；B組大鼠腎臟HE染色可見部分腎小球肥大，系膜細胞及系膜基質增生，毛細血管腔中度狹窄，細胞外基質大量聚集；C組大鼠腎臟HE染色可見腎小球系膜區增生較B組輕。見圖1。

A：正常對照組；B：腎病綜合征組；C：MZR干預組。

圖1各組大鼠腎臟光鏡表現(HE染色，400×)

2.3各組大鼠腎臟病理電鏡表現B組大鼠腎臟病理電鏡下可見足細胞出現廣泛融合，部分可見足突缺失，C組大鼠足細胞融合少于B組，但較A組足細胞損傷重。見圖2。

A：正常對照組；B：腎病綜合征組；C：MZR干預組。

圖2各組大鼠腎臟病理電鏡表現

3 討論

MZR是一種新型免疫抑制劑。研究發現，由于細胞內外存在濃度差，MZR在進入機體后由細胞外向細胞內移動，進入細胞后在腺苷激酶的作用下磷酸化形成活性物質MZ-5’-單磷酸化物，該物質能夠競爭性地抑制中間體肌苷酸脫氫酶和鳥苷酸合成酶，使細胞內鳥苷酸合成減少，從而抑制細胞增殖。由于增殖旺盛的淋巴細胞的鳥苷酸合成主要依賴從頭合成途徑，而中性粒細胞的鳥苷酸合成卻可同時通過從頭合成途徑和補救合成途徑進行，因此，MZR能夠特異性地抑制淋巴細胞的增殖，進而抑制抗體的產生[1]。早期臨床主要將MZR用于預防和抑制腎移植的排異反應，目前已逐漸將其用于治療兒童和成人的多種免疫相關性疾病，其在腎病綜合征、狼瘡性腎炎[3]、紫癜性腎炎[4]、IgA腎病[5]及類風濕關節炎等疾病的治療中均取得了良好的治療效果。

足細胞是位于腎小球毛細血管基底膜外側的臟層上皮細胞，足細胞足突之間的裂孔膜是腎小球濾過的最后一道屏障，足細胞損傷將導致蛋白尿出現。Wang等[6]研究發現，MZR治療激素依賴、激素抵抗的難治性腎病綜合征及特發性膜性腎病，能夠減少患者蛋白尿，但MZR治療難治性腎病綜合征的機制是否與減輕足細胞損傷有關，目前尚缺乏相關研究。

多項研究證實，阿霉素腎病大鼠可出現大量蛋白尿，是研究腎病綜合征發生機制最好的動物模型之一，其主要病變部位是腎小球足細胞。本研究成功制備阿霉素腎病大鼠模型，并觀察到MZR能夠降低腎病綜合征大鼠24 h尿蛋白水平，同時降低腎臟足突的融合程度，減輕足細胞損傷，降低細胞外基質聚集，提示MZR治療腎病綜合征可能與其對足細胞的保護作用有關，為臨床治療腎病綜合征提供了新的依據，但具體作用機制目前尚不清楚，有待于進一步研究。

[1] 黃倩.咪唑立賓在腎臟疾病中的應用[J].國際兒科學雜志,2012,39(3):252-254.

[2] 劉文靜,杜玄一.腎臟疾病足細胞保護機制研究進展[J].中國中西醫結合腎病雜志,2015,16(12):1112-1114.

[3] Aizawa T,Imaizumi T,Tsuruga K,et al.Mizoribine selectively attenuates monocyte chemoattractant protein-1 production in cultured human glomerular mesangial cell: A possible benefit of its use in the treatment of lupus nephritis[J].Nephrology(Carlton),2014,19(1):47-52.

[4] 李良志,劉雷,何先紅,等.咪唑立賓治療重癥過敏性紫癜性腎炎21例療效觀察[J].重慶醫學,2010,39(14):1904-1906.

[5] Masutani K,Tsuchimoto A,Yamada T,et al.Comparison of steroid-pulse therapy and combined with mizoribine in IgA nephropathy: a randomized controlled trial[J].Clin Exp Nephrol,2016,20(6):896-903.

[6] Wang X,Song X,Liu Y,et al.Treatment of membranous nephropathy with mizoribine: A control trial[J].Life Sci,2016,154:75-78.

Theeffectofmizoribineonpodocytelesionoftheratswithnephroticsyndrome

Tao Lin, Liu Bing

DepartmentofNephrology,HenanProvincialPeople’sHospital,Zhengzhou450003,China)

ObjectiveTo investigate the effect of mizoribine(MZR) on podocyte lesion of the rats with nephrotic syndrome.MethodsThirty-six male SD rats were randomly divided into normal control group (group A, 12 rats) and model group(24 rats). Rat nephrotic syndrome (model group) was established by injecting the adriamycin via the tail veinous injection (6.5 mg/kg), and the successful ones were randomly divided into group B (nephritic syndrome group, 10 rats) and group C (mizoribine intervention group, 10 rats). At the end of the eighth week after injection, the content of the 24-hour urine protein was determined by using coomassie brilliant blue staining, glomerular morphology was investigated by HE dyeing, and the morphology of the podocyte was studied by using transmission electron microscope.ResultsCompared with the group A and C, the 24-hour urine protein of the group B was higher, and the differences were statistically significant (P<0.05). The degree of podocyte lesion of the group B was greater than that of group A and C, and the deposition of extracellular matrix proteins was larger than that of the group A and C.ConclusionMZR can reduce the injury of the podocyte lesion and the deposition of extracellular matrix proteins, decrease the 24-hour urine protein of the rats with nephrotic syndrome, which provides theoretical basis for MZR in nephrotic syndrome.

mizoribine; nephrotic syndrome; rat; podocyte; 24-hour urine protein

河南省醫學科技攻關項目(201402028)。

劉冰，E-mail：bingliu6699@126.com。

R 692doi: 10.3969/j.issn.1004-437X.2017.18.001

2017-07-17)