多重耐藥性銅綠假單胞菌的分離鑒定及小鼠燒傷感染模型的建立

郝羽翀，劉洋洋，王亞利，史紅艷

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

多重耐藥性銅綠假單胞菌的分離鑒定及小鼠燒傷感染模型的建立

郝羽翀，劉洋洋，王亞利，史紅艷*

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

目的分離鑒定多重耐藥性銅綠假單胞菌，制備銅綠假單胞菌感染的小鼠燙傷模型。方法常規(guī)方法分離純化銅綠假單胞菌，并經(jīng)16sRNA序列分析鑒定銅綠假單胞菌；平板稀釋法測(cè)定分離菌株對(duì)18種抗菌藥物的耐藥性；應(yīng)用燙傷儀確定小鼠對(duì)100℃下不同燙傷面積和燙傷時(shí)間的耐受情況，確定最佳燙傷時(shí)間和面積建立小鼠燙傷模型；對(duì)小鼠燙傷模型皮下感染不同濃度的銅綠假單胞菌，確定72 h內(nèi)全部小鼠死亡的細(xì)菌最小致死量，最小致死量感染組小鼠死亡后立即應(yīng)用平板稀釋法檢測(cè)肝和脾內(nèi)細(xì)菌荷載量。結(jié)果分離鑒定得到5株多重耐藥性銅綠假單胞菌，其中耐藥種類最多的為PA53，該菌對(duì)檢測(cè)的18種抗菌藥物中的14種耐藥；燙傷溫度100℃，面積 2.5 cm2,燙傷時(shí)間10 s可獲得穩(wěn)定的小鼠燙傷模型；PA53對(duì)小鼠燙傷模型感染的最小致死量為1.8×1011CFU/ml,250 μl；死亡小鼠肝和脾內(nèi)的細(xì)菌荷載量分別為108PFU/g和1010PFU/g數(shù)量級(jí)。結(jié)論獲得多重耐藥性銅綠假單胞菌PA53；成功構(gòu)建小鼠燙傷模型，并測(cè)定了PA53對(duì)燙傷模型小鼠的最小致死量及死亡小鼠部分臟器的細(xì)菌荷載量。

多重耐藥性;銅綠假單胞菌；燒傷模型；最小致死量

(ChinJLabDiagn,2017,21:1432)

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染最主要的條件致病菌之一。患代謝性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者，以及術(shù)后或某些治療后的患者易感染本菌。它是重癥監(jiān)護(hù)室感染的第二位最常見的病原菌，燒傷時(shí)，焦痂下區(qū)域可成為大量細(xì)菌侵犯的場(chǎng)所，進(jìn)而成為引起菌血癥的病灶，而菌血癥常是燒傷的致死性并發(fā)癥[1]。近年來(lái)細(xì)菌耐藥情況愈發(fā)嚴(yán)重，多重耐藥性銅綠假單胞菌檢出率持續(xù)增高，為臨床燒燙傷感染的治療帶來(lái)巨大壓力。本文自臨床分離鑒定了多重耐藥性銅綠假單胞菌并建立了該菌的燙傷小鼠感染模型，以期為進(jìn)一步治療多重耐藥性銅綠假單胞菌燒燙傷感染提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠，雌性，體重16-18g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(吉)-2007-0003。

1.1.2 試劑 LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，加ddH2O定容至1 000 ml，調(diào)節(jié)pH約為7，121℃高壓滅菌 15 min；固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉33 g，加1 000 ml ddH2O，121℃高壓滅菌15 min；PCR試劑盒(TAKARA)。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 微量分光光度儀(酶標(biāo)儀)，澳大利亞TECAN公司；紫外分光光度儀，NanoDrop公司；細(xì)菌培養(yǎng)箱，DHP-120型，上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠；超凈工作臺(tái)，SW-CJ-IF型，蘇州安泰技術(shù)有限公司；生物安全柜，YJ-876型，蘇州安泰技術(shù)有限公司；燙傷儀，臺(tái)式超級(jí)控溫燙傷儀：YLS-5Q型，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 銅綠假單胞菌分離鑒定及耐藥性測(cè)定 臨床燒燙傷感染創(chuàng)面分離純化獲得產(chǎn)綠色水溶性色素的銅綠假單胞菌5株，經(jīng)梅里埃細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定，后參照何艷霞等人的文獻(xiàn)[2]，以5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′為引物， PCR 反應(yīng)體系為50 μl，包括上、下游引物各0.4 μmol/L，模板2 μl，2 × Taq Master Mix 25 μl。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延長(zhǎng)2 min，共30 個(gè)循環(huán)； 72 ℃終末延長(zhǎng)5 min。在PCR循環(huán)條件下行菌落PCR， 1%瓊脂糖凝膠電泳分離，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，經(jīng)BlastN比對(duì)測(cè)序結(jié)果。對(duì)16sRNA序列分析后確定為銅綠假單胞菌的菌株經(jīng)平板稀釋法測(cè)定其對(duì)抗菌藥物的耐藥性[3]，每種藥物濃度均設(shè)50、100、200及400 μg/ml四個(gè)濃度(表1)。選擇多重耐藥菌株制備小鼠燒傷感染模型。

1.2.2 銅綠假單胞菌擴(kuò)增及濃度測(cè)定 將新鮮培養(yǎng)的銅綠假單胞菌溶液進(jìn)行系列稀釋后，用微量分光光度儀在600 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，并將不同吸光度的細(xì)菌溶液稀釋后涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基上[4]，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算各細(xì)菌溶液的細(xì)菌濃度(CFU/ml)，并對(duì)照原600 nm吸光度。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，根據(jù)三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制細(xì)菌濃度及吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。應(yīng)用時(shí)根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定吸光度，調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度。

1.2.3 小鼠燙傷模型的制備 16-18 g的ICR雌性小鼠，稱重記錄，隨機(jī)分組，每組8只。通過(guò)腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉劑量為0.2%戊巴比妥鈉50 μl[5]。將麻醉后的小鼠固定，露出后背4.5 cm ×1.8 cm的剃毛區(qū)域，進(jìn)行脫毛處理。燙傷儀在小鼠背部皮膚較厚處，采用不同面積的平探頭進(jìn)行100℃燙傷，根據(jù)面積和時(shí)間設(shè)定2.5 cm2/10 S、2.5 cm2/15 S、3.0 cm2/10S、3.0 cm2/15 S四組，燙傷后立刻用0.5 ml生理鹽水進(jìn)行皮下注射，補(bǔ)充燙傷后滲出的組織液。觀察72 h內(nèi)小鼠的活動(dòng)狀況(表2)。

1.2.4 銅綠假單胞菌感染燙傷小鼠最小致死量測(cè)定 燙傷后，各組小鼠分別皮下注射濃度為1.8×1012、1.8×1011、1.8×1010、1.8×109、1.8×108、1.8×107CFU/ml 的銅綠假單胞菌菌液250 μl；對(duì)照組小鼠注射同體積的生理鹽水(表3)。將處理完的小鼠置于溫暖明亮且舒適的環(huán)境中等待其蘇醒，72 h不間斷密切觀察，記錄各組小鼠死亡數(shù)，確定皮下注射導(dǎo)致小鼠死亡的銅綠假單胞菌的最小濃度[6]。

2 結(jié)果

2.1 銅綠假單胞菌分離鑒定結(jié)果及耐藥性測(cè)定 分離獲得的5株產(chǎn)綠色水溶性色素的細(xì)菌，經(jīng)16sRNA序列分析，均為銅綠假單胞菌，見圖1。5株銅綠假單胞菌均為多重耐藥菌，其中PA53對(duì)檢測(cè)的18種抗生素中的14種耐藥，4種敏感抗生素為頭孢吡肟、亞胺培南、頭孢噻肟和硫酸慶大霉素。在耐藥的14種抗生素中，除氨曲南和硫酸鏈霉素的耐受濃度為50 μg/ml外，400 μg/ml鹽酸的頭孢唑肟、頭孢米諾、頭孢呋辛、頭孢西丁鈉、鹽酸莫西沙、鹽酸左氧氟沙星等亦無(wú)法抑制PA53的生長(zhǎng)。

圖1 16sRNA電泳結(jié)果圖

2.2小鼠燙傷模型建立2.5cm2/10s燙傷組小鼠，在72h內(nèi)無(wú)死亡，且在48-72h內(nèi)，滲出的組織液逐漸吸收，燙傷處的皮膚開始皺縮結(jié)痂，持續(xù)觀察至120h后亦無(wú)小鼠死亡，適合用于進(jìn)行細(xì)菌燙傷感染模型的建立。而其他組別在72h內(nèi)均有小鼠死亡，故選擇100℃，2.5cm2/10s燙傷刺激來(lái)制備銅綠假單胞菌感染的小鼠燙傷模型(表2)。

表1 銅綠假單胞菌耐藥性測(cè)定結(jié)果

—”表示不耐藥,數(shù)字代表耐受的藥物濃度

表2 小鼠燙傷模型建立結(jié)果

2.3 銅綠假單胞菌感染小鼠最小致死量及死亡小鼠肝臟及脾臟內(nèi)細(xì)菌荷載量檢測(cè) 見表3。結(jié)果顯示感染燙傷小鼠100%死亡的PA53的最小致死量為1.8×1011CFU/ml×250 μl，可導(dǎo)致小鼠在48 h內(nèi)死亡。最小致死量組全部死亡小鼠肝臟和脾臟的細(xì)菌負(fù)荷量分別達(dá)到1010CFU/g，108CFU/g(表4)，說(shuō)明皮下注射感染的PA53可快速增殖并擴(kuò)散到臟器中，細(xì)菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素及外毒素等使?fàn)C傷小鼠在48 h內(nèi)全部死亡，病程進(jìn)展快速兇險(xiǎn)。

表3 銅綠假單胞菌感染燙傷小鼠的最小致死量測(cè)定結(jié)果

表4 最小致死量感染組死亡小鼠脾臟和肝臟的細(xì)菌濃度

3 討論

藥敏實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的臨床常用的18種抗菌藥物中，PA53對(duì)其中14種耐藥，對(duì)12種耐藥濃度達(dá)到了400 μg/ml。其余4株銅綠假單胞菌菌株亦為多重耐藥菌株，分別對(duì)12種(PA32)、13種(PA78)、12種(PA90)、13種(PA97)抗菌藥物耐受。目前，各類臨床感染中分離的MDRPA越來(lái)越多，治療困難[7]。傳統(tǒng)抗菌藥物治療所面臨的困難，使開發(fā)噬菌體等生物制劑治療MDRPA感染迫在眉睫。國(guó)外已有應(yīng)用噬菌體治療銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌感染燒燙傷患者的報(bào)道[6,8,9]。本實(shí)驗(yàn)室在建立燙傷感染模型的同時(shí)，也在分離鑒定可高效裂解PA53的噬菌體，為進(jìn)一步開發(fā)噬菌體等生物制劑治療銅綠假單胞菌燙傷感染提供基礎(chǔ)。

小鼠燙傷模型制備中燙傷面積及燙傷時(shí)間是參照相關(guān)文獻(xiàn)，并經(jīng)過(guò)多次反復(fù)摸索后確定的，在72 h內(nèi)燙傷小鼠可存活且具有相對(duì)良好的活動(dòng)狀態(tài)，在不合并感染的情況下，5-7 d燙傷創(chuàng)面可以結(jié)痂并逐漸恢復(fù)，可保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。

銅綠假單胞菌PA53，在 1.8×1011CFU/ml，250 μl的皮下注射量下，可以在48小時(shí)內(nèi)導(dǎo)致燙傷小鼠100%的死亡量；在此感染劑量下，死亡小鼠的肝和脾內(nèi)的細(xì)菌荷載量分別達(dá)到了108CFU/g和1010CFU/g數(shù)量級(jí)，說(shuō)明PA53可以快速侵襲進(jìn)入小鼠的組織器官并大量增殖。通過(guò)細(xì)菌內(nèi)毒素、外毒素及各種酶類等作用導(dǎo)致燙傷小鼠在48 h內(nèi)死亡，可較好的模擬進(jìn)展迅速、病情兇險(xiǎn)的臨床燒燙傷感染的病程。

[1]史紅艷，劉 克，李菁華，等.銅綠假單胞菌PA16株粘附性、菌毛與質(zhì)粒關(guān)系的研究[J].微生物學(xué)雜志，2001，21(4)：35.

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[3]夏永祥，陳 杰.細(xì)菌耐藥性分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010,(11):1866.

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Isolationandidentificationofmulti-drugresistantPseudomanasareuginosaandburnedmiceinfectionmodelconstruction

HAOYu-chong,LIUYang-yang,WANGYa-li,etal.

(TheBasicMedicalSchoolofJilinUniversity,Changchun130021,China)

ObjectiveIn order to isolate and identify the multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa(MDRPA) and rebuilt infection model of burned- mice by MDRPA.MethodsThe burned-mice model was rebuilt by burning instrument according to different area and time at 100℃.Pseudomonas aeruginosa was isolated and purified by the conventional method,and identified by 16sRNA sequence analysis ; The 18 kinds of anti-bacterial drugs were administrated to MDRPA by plate dilution method; Different concentrations of MDRPA were infected by subcutaneous injection to burned-mice model to measure the 100% minimum lethal dose within 72h; And the loading bacteria of spleens and livers of the dead mice in 100% minimum lethal dose infection group were tested by plate dilution method.ResultsThe multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa PA53 was selected finally,this bacterial is resistant to 14 kinds of antibiotics of all 18.The burn area and burn time were 2.5 cm2,10 s.The minimum lethal dose of PA53 to burned-mice was 1.8×1011CFU /ml,250 μl; The concentration of PA53 in liver and spleen were108PFU/g and1010PFU/g respectively.ConclusionA multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa PA53 was isolated and identified,and the burned-mice infection model was successfully constructed.The minimal lethal dose of PA53 and the bacterial loading of spleen and liver of dead mice were measured.

multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa; burned-mice model; minimum lethal dose

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1432-04

R375

：A

2017-03-22)