外周血CPNE3表達異常可能作為評估穩定冠心病發展為急性心肌梗死的遺傳標志

王 孟，譚卜川，楊玉雙，劉 龍，劉雪巖，孟繁波

(1.吉林大學臨床醫學院 2013級臨床五班，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯誼醫院 心血管內科，吉林 長春130033)

外周血CPNE3表達異常可能作為評估穩定冠心病發展為急性心肌梗死的遺傳標志

王 孟1，譚卜川2*，楊玉雙2，劉 龍2，劉雪巖2，孟繁波2*

(1.吉林大學臨床醫學院 2013級臨床五班，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯誼醫院 心血管內科，吉林 長春130033)

基因COPINE III可能和一種具有內在激酶活性的磷蛋白有關，屬于一類非傳統的激酶家族[1]。CPNE3基因相較在穩定冠心病(SCAD)患者中比在急性心肌梗死(AMI)患者中差異性低表達，表達倍數為0.484倍[2]。本研究欲通過擴大臨床資料樣本量的方法，來進一步驗證CPNE3基因是否能預測AMI發生，并評估CPNE3基因外周血表達量對于AMI的診斷價值以及外周血CPNE3基因表達產物是否可作為急性心梗風險評估的生物標志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年4月-2016年11月于吉林大學中日聯誼醫院心血管內科住院治療并行冠脈造影術的患者，依據2012年公布的心肌梗死全球統一定義[3]明確診斷為AMI的病人 91 例為AMI組，SCAD[4]患者87例為對照組。排除標準：①和經皮冠狀動脈介入治療(PCI)或冠狀動脈旁路移植術(CABG)相關的心肌梗死。②MI type II。繼發于供血失衡相關的心梗：如兒茶酚胺水平升高或冠脈痙攣導致的心梗。③伴有心臟手術或非心臟手術的心梗。④合并多因素或不確定疾病的心肌損傷。⑤患有免疫系統疾病和(或)正在服用激素。⑥(活動性或潛伏性)結核感染史或證據。⑦正在患有的、慢性的或復發性的傳染性疾病史。⑧合并有嚴重感染性疾病、惡性腫瘤。懷疑或證實處于免疫缺陷狀態的患者。⑨臨床資料或者冠脈造影資料不全者。詳細記錄臨床資料，包括：血脂水平、空腹血糖水平、靜息血壓、體質指數(BMI)、冠心病家族史、吸煙史、冠狀動脈造影資料，以及合并其它臨床疾病情況(如高血壓、糖尿病)等。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血采集、總RNA提取及cDNA合成 留取各研究對象晨起空腹外周靜脈血4 ml，利用血液總 RNA 提取試劑盒(RNAsimple TotalRNA Kit,天根生化科技有限公司，北京)，依據試劑盒說明書對已獲取的外周血進行總 RNA提取，并利用 1.5%瓊脂糖電泳及紫外分光光度計(Nanodrop 2000)對RNA的質量及濃度進行檢測。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測 利用SYBR熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex Taq TM，TaKaRa,大連)進行PCR擴增。依據試劑盒說明書應用 Mx3005P 實時熒光定量PCR系統(Strata Gene)擴增。反應條件為95℃預變性1 min；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環，反應結束之后， 記錄60℃-95℃溫度范圍內的熔解曲線及擴增曲線，產物4℃保存 備用。每個樣本所得循環閾值(Ct)以相對表達量 2-△Ct表示(△Ct=目的基因Ct值-內參基因Ct值)，并進行比較。急性心肌梗死組對于對照組的相對表達量以 2-△△Ct法進行統計分析[5]，△△Ct=急性心肌梗死組△Ct-穩定冠心病組△Ct。所用 PCR 引物根據 NCBI 數據庫提供的CPNE3基因序列進行設計，并由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列

Fa,sequence from sense strands.Rb,sequence from anti-sense strands.

1.3 統計學分析

1.4 倫理聲明

本研究由吉林大學中日聯誼醫院倫理委員會批準。所有受試者的樣本及信息采集均通過受試者同意，并簽署知情同意書。

2 結果

2.1 臨床資料分析

研究對象的臨床資料分析結果表明：在性別、 BMI、高血壓病史、冠心病家族史、收縮壓、舒張壓及血清甘油三酯水平(TG)、血清總膽固醇水平(TC)、低密度脂蛋白膽固醇水平(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等方面，兩組未見明顯統計學差異。AMI組患者年齡明顯高于SCAD組，差異有統計學意義，詳見表 2。

表2 AMI組與SCAD組臨床資料比較

2.2 CPNE3基因實時熒光定量 PCR 擴增產物鑒定

外周血 RNA 實時熒光定量 PCR 檢測結果顯示：CPNE3基因擴增曲線為顯著平滑的“S 型”。溶解曲線呈現單一的溶解峰，擴增產物特異性較高。

2.3 CPNE3 基因 mRNA水平相對表達量在AMI組和SCAD組間比較分析

RT-PCR 所得每個樣本的ΔCt 值均為單個樣本重復3次測量所得均值。結果顯示，AMI組 2-△Ct為 0.020(0.016-0.032)，SCAD組2-△Ct為0.029(0.021-0.067)，兩組差別有顯著統計學差異(Z=-4.231，P=0.000)。AMI患者外周血中CPNE3基因mRNA相對表達量明顯低于SCAD患者，且其相對表達量為SCAD組的0.69倍。詳見圖1。

2.4 外周血CPNE3基因蛋白水平表達結果分析

本研究中以β-actin 為內參基因，對患者外周血進行蛋白水平的檢測。Western Blot 結果顯示：AMI組與SCAD組在β -actin 基因蛋白水平表達上無明顯差異，而在CPNE3基因蛋白水平表達上差異顯著，與SCAD患者相比，AMI患者在蛋白水平為低表達，AMI組CPNE3蛋白表達為SCAD組的 0.356倍，詳見圖2。

2.5 CPNE3基因相對表達量與年齡、血清血脂、血糖等的相關性分析

本組資料表明，CPNE3基因的mRNA水平表達量、患者年齡在AMI和SCAD兩組比較均存在差異性。進一步分析CPNE3基因mRNA表達量與患者年齡、空腹血糖、血清血脂水平是否有關。將所有納入的研究對象依據血脂水平分層標準[6]分為：TC 正常組(<5.18 mmol/L)和TC 升高組(≧5.18 mmol/L)、TG正常組(<1.76 mmol/L)、TG升高組(≧1.76)、LDL-C正常組(<3.37 mmol/L)和LDL-C 升高組(≧3.37 mmol/L)、HDL-C正常組(≧0.907)、HDL-C降低組(<0.907)。依據空腹血糖標準水平[7]將所有研究對象分為：血糖正常組(≤6.0)、血糖升高組(>6)。依據所有研究對象以年齡做AMI的ROC曲線的cut off值將所有納入的研究對象分為：高齡組(>66.5歲)和 低齡組(≤66.5歲)。每個研究對象CPNE3基因mRNA水平的相對表達量以2-△Ct表示，分別比較各組間 與CPNE3基因表達量的相關性。結果顯示：CPNE3基因mRNA表達量在高齡組與低齡組之間有差異(P=0.008)；CPNE3基因mRNA表達量與血清血脂、血糖均無關。結果詳見表3。

2.6 采用 Logistic 回歸分析 CPNE3基因mRNA水平表達量及患者年齡與急性心肌梗死的關系

按CPNE3 基因的相對表達量cut off值將所有研究對象分為高表達組(2-△Ct>0.013)和低表達組(2-△Ct≤0.013)，進一步采用逐步二元 Logistic 回歸分析CPNE3基因mRNA水平表達量、患者年齡與AMI的相關性。結果表明：CPNE3基因低表達、患者高齡是AMI的獨立危險因素，與CPNE3高表達相比，CPNE3基因低表達組AMI的風險增加2.845倍，高齡使AMI風險增加了1.605倍。詳見表4。

表3 CPNE3基因mRNA表達量與患者年齡相關性分析

表4 急性心肌梗死獨立危險因素logistic回歸分析結果

2.7 CPNE3基因相對表達量在急性心肌梗死診斷中的ROC曲線和cut off值

根據急性心肌梗死組和對照組各樣本實時熒光定量 PCR 所得CPNE3相對表達量 2-△CT值繪制 ROC 曲線，見圖3。從圖3可知 CPNE3基因的相對表達量對急性心肌梗死的診斷具有一定的參考價值，曲線下面積(AUC)為0.684±0.040。以約登指數最大值確定的 CPNE3基因相對表達量cut off值0.024，診斷AMI的敏感度為0.690，特異性為0.648，陽性預測值68.6%，陰性預測值65.2%。

2.8CPNE3基因相對表達量與冠狀動脈病變嚴重程度的相關性分析

根據冠狀動脈造影結果，按照Gensini評分系統對所有研究對象冠狀動脈病變嚴重程度進行評分[8]。分值越高代表冠狀動脈狹窄越重。所有研究對象Gensini評分結果為25(9.5-52)，對CPNE3基因和Gensini分值進行雙變量相關分析，結果顯示：CPNE3基因mRNA表達量與Gensini分值呈顯著負相關(rs=-0.200，P=0.018)，即CPNE3基因mRNA的相對表達量越低，Gensini分值越高，冠狀動脈病變則越重。

2.9CPNE3基因的相對表達量與心肌肌鈣蛋白I(TnI)的相關性

急性心肌梗死組心肌肌鈣蛋白檢測結果為0.790(0.138-8.760)ng/ml。血清肌鈣蛋白I(TnI)濃度的高低反應了急性心肌梗死范圍的大小。血清TnI和CPNE3基因相對表達量的雙變量相關分析結果顯示：外周血中CPNE3基因表達量與血清TnI濃度無關(rs=-0.144，P=0.364)。即CPNE3基因mRNA水平表達量與心肌梗死的范圍無關。

2.10CPNE3基因相對表達量與急性心梗患者發病距采血時間的相關性

以急性心肌梗死患者過去一周內初發的長時間(≥20min)靜息痛作為發病時間點，急性心肌梗死組患者發病距采血的時間即為發病時間，結果為24(11-72)h。CPNE3基因相對表達量和急性心肌梗死發病時間相關分析結果顯示：外周血中CPNE3基因表達量與急性心肌梗死發病時間長短無關(rs=-0.098，P=0.533)

3 討論

本研究發現，與SCAD患者相比，AMI患者外周血CPNE3基因表達量無論在mRNA水平還是在蛋白表達水平均為低表達。Copine家族在細胞中的具體作用尚不明確，也有些證據顯示其可能參與了膜蛋白、脂質以及其他活動[9]。近來，多有報道關于CPNE3在癌癥中的作用，尤其是促使癌細胞遷移[10]。CPNE3與ErbB2相互作用促進腫瘤轉移，其在非小細胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢腫瘤中均發揮作用[10-12]。CPNE3還被證實和精神分裂癥有關[13]。但是并沒有關于CPNE3在心血管疾病的發生和發展中作用的研究。本研究在前期工作基礎之上，進一步擴大樣本量驗證了CPNE3基因在急性心肌梗死患者外周血中無論mRNA水平還是蛋白質水平均為低表達。

雖然通路分析顯示，CPNE3基因廣泛參與著免疫調節，中性粒細胞脫顆粒，包括脂肪酸、甘油三酯、膽固醇等脂質、脂蛋白和酮體等的代謝(fromREACTOME)。但是根據本組資料顯示，CPNE3基因的低表達和血糖、血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇并無相關性。故其促進AMI的機制可能并非是通過影響血脂、血糖代謝。

盡管不明確CPNE3基因促使AMI發生的發病機制。但本實驗進一步通過二元Logistic回歸分析結果表明，CPNE3基因低表達是AMI的獨立危險因素，CPNE3基因低表達使SCAD患者患AMI的風險增加2.845倍，患者高齡是AMI獨立危險因素，使AMI風險增加了1.605倍。

用CPNE3基因mRNA表達量來做ROC曲線結果表明：外周血CPNE3基因mRNA表達量可以用于診斷穩定冠心病發展為急性心梗的遺傳標志物，診斷AMI的敏感度為0.690， 特異性為0.648，陽性預測值68.6%，陰性預測值65.2%。因此CPNE3基因做為診斷AMI的生物標記有一定的價值。

本研究結果還表明，CPNE3基因相對表達量與冠狀動脈病變嚴重程度Gensini評分有關。Gensini評分應用定量冠狀動脈造影的方法，測定病變嚴重程度，對于不同病變程度采用不同的權重，評分的高低主要與冠狀動脈狹窄程度及供血范圍相關[16]。即CPNE3基因的相對表達量越低，Gensini分值越高，則冠狀動脈病變越重。因此，依據本研究可以推測，CPNE3基因表達量與冠狀動脈病變嚴重程度有關。

CPNE3基因表達量與心肌肌鈣蛋白I(TnI)的相關性分析證實CPNE3基因的表達量與心肌肌鈣蛋白的量無關，而心肌肌鈣蛋白的量反映心肌梗死的范圍，所以CPNE3基因的表達量可能與心肌梗死面積大小無關。同時本研究還表明CPNE3基因表達量與急性心肌梗死發病時間無關。發病時間即患者急性心肌梗死發病距采血的時間。一般認為：如果CPNE3基因的低表達是伴隨急性心肌梗死發生的，那么CPNE3基因的表達量會與心肌肌鈣蛋白I(TnI)濃度及AMI發病時間均有相關性。如果CPNE3基因低表達是導致急性心肌梗死的病因之一，那么CPNE3基因的表達量會與心肌肌鈣蛋白I(TnI)濃度及AMI發病時間均無相關性。

故通過本研究結果，我們可以合理推測，CPNE3基因低表達可能通過影響冠狀動脈病變，促進了急性心肌梗死的發生。如果想要完全明確CPNE3基因低表達是否為急性心肌梗死的病因之一，尚需設計前瞻性研究來回答這一問題。至少通過本研究證明，CPNE3并非通過影響空腹血糖、血清TC、TG、LDL-C水平促進AMI發生。為明確CPNE3基因與糖代謝和脂類代謝以及進一步的急性心肌梗死關系，有待對CPNE3基因的生物學功能進一步明確。

結論：與SCAD患者相比，AMI患者外周血CPNE3基因低表達。CPNE3基因低表達是穩定型冠心病向急性心肌梗死進展中的獨立危險因素，CPNE3基因的低表達使AMI的風險增加了2.845倍。外周血CPNE3基因mRNA表達量可以用于診斷為急性心梗的遺傳標記。CPNE3基因可能是通過影響冠狀動脈血管，促進了急性心肌梗死的發生，CPNE3基因是促進穩定冠心病患者發生急性心肌梗死的重要遺傳因素之一。

致謝：感謝吉林大學畜牧獸醫學院趙志輝教授及其團隊對本研究提供的技術指導。

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新世紀優秀人才支持計劃(2008)；吉林省科技廳資助(20090734)；吉林省財政廳資助(2012009)

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1366-06

2017-02-26)