急性白血病病人外周血NK細胞檢測的臨床意義

孔令環，劉 穹，邢明雨，韓 梅，肖中平，王新梅

(吉林省人民醫院，吉林 長春130021)

急性白血病病人外周血NK細胞檢測的臨床意義

孔令環*，劉 穹，邢明雨，韓 梅，肖中平，王新梅

(吉林省人民醫院，吉林 長春130021)

目的探討急性白血病病人外周血NK(CD3-CD16+CD56+)細胞檢測的臨床意義。方法用流式細胞術檢測18例正常對照及54例急性白血病病人外周血NK細胞占淋巴細胞百分比，NK細胞膜活化性受體NKG2D和抑制性受體NKG2A及穿孔素、顆粒酶的表達。結果(1)白血病初治組NK細胞數量顯著低于正常對照組(P<0.05)，緩解組、復發組與正常對照組均無顯著性差異(P>0.05)；(2)初治組、復發組活化性受體NKG2D均顯著低于正常對照組(P<0.05)；初治組、緩解組、復發組抑制性受體NKG2A與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)。(3)初治組、復發組的穿孔素表達均顯著低于正常對照(P<0.05)。結論NK細胞數量減少及NKG2D、穿孔素表達減少可能與白血病病人發病及復發有關。

白血病；急性；NK細胞；受體；穿孔素；顆粒酶

(ChinJLabDiagn,2017,21:1311)

急性白血病是嚴重威脅人類健康的重大疾病，其發生、發展與機體免疫功能紊亂有關[1,2]；而導致白血病難以治愈和容易復發的原因也與機體免疫功能的低下及免疫逃逸機制形成有關。NK(CD3-CD16+CD56+)細胞作為機體免疫系統的重要組成成分，不需要抗原致敏，即可非特異殺傷靶細胞。本研究通過檢測外周血NK細胞數量及活化性受體及抑制性受體的表達，來探討NK細胞數量、功能的變化在急性白血病發病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取本院2016年1-12月急性白血病住院病人54例為研究對象，其中初治組22人，緩解組16人，復發組16人。初治組男13例，女9例，年齡22-68歲，ALL 6例，M26例，M56例，M34例，均經MICM 分型確診。對照組18例，均為本院健康體檢者，男10例，女8例，年齡31-53歲。標本的留取均獲得知情同意。

1.2 試劑和儀器

單抗購自BCM公司，鼠抗人CD3-ECD、CD16-PC5 、CD56-PC5、CD314-FITC(活化性受體NKG2D)、CD159- PE(抑制性受體NKG2A)、胞質蛋白perforin-FITC(穿孔素)、granzyme β-PE(顆粒酶β)、同型對照、溶血素、破膜劑；流式細胞儀為美國貝克曼公司的多參數EPICS XL型流式細胞儀，應用EXPO32ADCXL4 Color軟件分析，在FSC-SSC散點圖上選定淋巴細胞群，結果以百分率表示。

1.3 方法

受試者于清晨空腹采靜脈血2 ml，EDTA抗凝。

1.3.1 流式細胞術檢測胞膜蛋白 1號Falcom管加入抗體CD3-ECD、CD16- PC5、CD56-PC5、NKG2A-PE、NKG2D-FITC各20 μl用于標記NK細胞和NKG2A、NKG2D；再加100 μl外周血，充分混勻，室溫避光孵育15 min，加入溶血劑500 μl，混勻，室溫避光10 min，加入適量PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加500 μl PBS，上機分析NK細胞及受體表達率。由此檢出的NK細胞包含CD16低表達CD56bright 亞型和CD16高表達的CD56dim亞型。

1.3.2 流式細胞術檢測胞質蛋白 2號Falcom管加入抗體CD3-ECD、CD16- PC5、CD56-PC5各20 μl，再加100 μl外周血,充分混勻，室溫避光孵育15 min,加入Reagent A 100 μl，混勻，室溫避光10 min，1倍溶血素2 ml，混勻避光10 min，離心，去上清，再將50 μl Reagent B加入上述溶血后的試管中，室溫避光10 min，破膜、固定，加PBS液1 ml洗1次，離心棄上清，依次加入perforin-FITC、granzyme β- PE單抗各20 μl，4℃避光孵育15 min，加PBS液1 ml洗滌2遍，加500 μl PBS，上機分析NK細胞胞漿內穿孔素、顆粒酶-β表達陽性率。

1.4 統計學處理

由SPSS17.0統計軟件完成統計分析，所有數據以(均值±標準差)表示，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 急性白血病病人外周血NK細胞占淋巴細胞的百分比

急性白血病病人初治組外周血NK(CD3-CD16+CD56+)細胞占淋巴細胞的百分比顯著低于正常對照組(P<0.05)；急性白血病病人緩解組及復發組外周血NK(CD3-CD16+CD56+)細胞占淋巴細胞的百分比與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.2 急性白血病病人NK細胞膜活化性受體、抑制性受體表達

急性白血病病人初治組、復發組活化性受體NKG2D均顯著低于正常對照(P<0.05)；緩解組活化性受體NKG2D與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)。急性白血病病人初治組、緩解組、復發組抑制性受體NKG2A與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.3 急性白血病病人外周血NK細胞胞質穿孔素、顆粒酶-β表達

急性白血病病人初治組、復發組的穿孔素表達均顯著低于正常對照組(P<0.05)；緩解組的穿孔素表達與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)。急性白血病病人初治組的顆粒酶-β的表達顯著低于正常對照組(P<0.05)；緩解組、復發組的顆粒酶-β的表達與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 外周血NK細胞及表面受體及胞質蛋白表達(均值±標準差)%

注：與對照組比較，aP<0.05

3 討論

自然殺傷(NK)細胞是機體免疫系統的重要組成成分，不需要抗原致敏即可非特異殺傷靶細胞。正常情況下NK細胞約占外周血的10%-20%，有研究報道[3，4]，NK細胞數量減少可導致機體免疫功能下降，往往與腫瘤的發生發展有著密切聯系。賀建霞等報道[5]，非霍奇金淋巴瘤初治患者外周血NK細胞數低于健康人；鄭淑霞等[3]報道，AML急性期和淋巴瘤急性期NK細胞數與對照組比有顯著差異。本研究發現，急性白血病初治組NK細胞數量減低，與正常對照組有顯著性差異(P<0.05)；緩解組、復發組NK細胞數與正常對照無顯著性差異，與報道一致。

NK細胞的抗腫瘤活性與其表面受體的表達水平有密切聯系，NK細胞的表面受體有許多種，根據其功能可分為活化性受體和抑制性受體。其中活化性受體NKG2D是C型凝集素樣受體，是NKG2家族中免疫活性最強的活化性受體，也是目前公認的在抗腫瘤免疫應答中發揮關鍵作用的受體，表達于絕大多數NK細胞表面，其表達水平幾乎決定了機體NK細胞免疫應答的強弱，在抗腫瘤免疫中起重要作用[6]。本研究發現，白血病初治組、復發組的NK細胞活化性受體NKG2D均顯著低于正常對照組(P<0.05)；緩解組活化性受體NKG2D與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)。 初治組、緩解組、復發組抑制性受體NKG2A與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)。因此，考慮白血病病人的免疫功能降低與NKG2D表達減少有關，可能是白血病病人發病及復發的原因,與報道一致[7]。緩解組NKG2D表達明顯提高，提示經過化療后病人的免疫功能得到恢復，與顧科峰[8]等報道一致。

研究還發現，白血病初治組的穿孔素及顆粒酶-β 表達均顯著低于正常對照組(P<0.05)，而緩解組病人的穿孔素及顆粒酶-β表達與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)；可能是白血病發病時NK細胞功能不足的一種表現。復發組的穿孔素表達顯著低于正常對照組(P<0.05)，至于穿孔素在白血病復發中有何意義，由于標本量少，尚需進一步研究。

綜上所述，白血病病人初治組NK細胞數量減少，初治組、復發組活化性受體NKG2D及穿孔素表達均減少，而緩解期均恢復正常。表明NK細胞的這一變化可能與疾病的狀態有關，所以，動態監測以上指標可進行白血病病情監測及預后判斷。

[1]齊 紅，石 虹，劉玉俠，等.253例惡性腫瘤患者外周血T淋巴細胞亞群的檢測及其臨床意義分析[J].中國實驗診斷學，2009，13(11)：1589.

[2]楊德芬.外周血T淋巴細胞亞群檢測在惡性腫瘤中的應用及臨床意義[J].海南醫學院學報，2013，19(10)：1390.

[3]鄭淑霞，謝若騰，官瑞婷，等.惡性血液病患者外周血NK細胞數量變化及意義[J].中國實驗血液學雜志，2015,23(4)：1133.

[4]Bari A,Marcheselli L,Sacchi S,et al.Prognostic models for diffuse large B-cell lymphoma in the rituximab era:a never-ending story[J].Ann Oncol,2010,21:1486.

[5]賀建霞，趙志強，王艷峰，等.非霍奇金淋巴瘤患者外周血T細胞亞群及NK細胞檢測的臨床意義[J].白血病.淋巴瘤,2013，22(7)：436.

[6]常 鑫，馬 莉，曾小菁，等．白血病患者NK細胞表面NKG2D受體及其配體MICA/B的研究[J]．中國免疫學雜志，2009,25(2):174．

[7]Sun C,Sun H,Zhang C,et al.NK cell receptor imbalance and NK cell dysfunction in HBV infection and hepatocellular carcinoma[J].Cell Mpl Immunol,2015,12(3):292．

[8]顧科峰，陳琳軍，鄧曉輝，等．惡性血液病治療惡性血液病患者治療前后外周血NK細胞亞群變化的特點及其臨床意義[J]．實用醫學雜志，2013，29(13)：2154．

Significanceofnaturalkillcellperipheralbloodofpatientswithacuteleukemia

KONGLing-huan,LIUQiong，XINGMing-yu,etal.

(JilinProvinceHospital,Changchun130021,China)

ObjectiveTo explore The clinical significance of NK(CD3-CD16+CD56+) cell in peripheral blood of acute leukemia.MethodsBy flow cytometry，the percentage of NK cell in peripheral blood lymphocytes was detected in 54 acute leukemia and 18 healty adults .NK cell activation receptor (NKG2D),inhibitory receptor (CD159),perforin and granzyme of patients were also detected.Results(1)The percentage of NK cell in newly diagnosed acute leukemia patients was significantly lower than of normal controls(P<0.05).But it had no significant of the CR group and relapse group than that of normal controls(P>0.05).(2)The expression of NKG2D both in the newly diagnosed group and relapse group were significantly lower than that of normal controls(P<0.05).But the expression of NKG2A among the 3 groups had no significant than that of normal controls(P>0.05).(3)The expression of perforin and granzyme both in the newly diagnosed group and relapsegroup significantly lower than that of normal controls(P<0.05).ConclusionPerhaps,the lowered percentage of NK ,lowered expression of NKG2D and perforin had correlation with pathogenesy and relapse of acute leukemia

Leukemia;Acute;Natural killer cell;Receptor;Perforin;Granzyme

吉林省科技廳項目(20150101145JC)

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1311-03

R733.71

：A

2017-03-04)