microRNA-376a在結(jié)直腸癌中的表達及其臨床意義

王金艷，張志勇，張學明，馮俊偉，李雪梅，甄曉月，徐晉珩，胡月明，張 林，吳晨鵬

(唐山市工人醫(yī)院 1.肛腸科；2.病理科；3.腫瘤外科，河北 唐山063000)

microRNA-376a在結(jié)直腸癌中的表達及其臨床意義

王金艷1，張志勇2*，張學明1，馮俊偉3，李雪梅2，甄曉月1，徐晉珩2，胡月明2，張 林2，吳晨鵬2

(唐山市工人醫(yī)院 1.肛腸科；2.病理科；3.腫瘤外科，河北 唐山063000)

目的檢測microRNA-376a(miR-376a)在腫瘤組織和對應(yīng)的切緣無瘤黏膜組織中的表達，并分析其與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系。方法收集28例結(jié)直腸癌患者組織標本，應(yīng)用實時定量PCR法，檢測miR-376a在腫瘤組織和與其相鄰的無瘤切緣黏膜組織中的表達；并分析miR-376a的相對表達水平與患者的不同病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果miR-376a在結(jié)直腸癌組織和切緣無瘤組織中的相對表達水平中位數(shù)分別為1.164和1.685，四分位數(shù)間距分別為(0.326，1.966)和(1.079，2.332)；與無瘤黏膜組織比較，結(jié)直腸癌組織中miR-376a表達顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義。miR-376a的表達水平與患者的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和腫瘤標志物CEA密切相關(guān)。結(jié)論miR-376a可能作為抑癌因子在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑制腫瘤生成的作用，并抑制了結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程。

結(jié)直腸癌；Micro RNA-376a；臨床病理特征

(ChinJLabDiagn,2017,21:1305)

近年研究顯示，microRNA-376a(miR-376a)在食管癌[1]組織、肺癌組織[2]中表達上調(diào)，在乳腺癌[3]、卵巢癌患者血漿中表達增高[4,5]，在氧化偶氮甲烷誘導(dǎo)的大鼠CRC中，miR-376a的表達水平與CRC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-376a與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究較少。本研究主要分析miR-376a在結(jié)直腸癌組織中的表達水平與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展、淋巴結(jié)浸潤、遠處轉(zhuǎn)移及腫瘤標志物表達之間的關(guān)系，為結(jié)直腸腺癌的診斷、治療及預(yù)后判斷提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選取2015年1月到2016年1月的28例新鮮組織標本，取自唐山工人醫(yī)院。選取患者結(jié)直腸腫瘤組織和切緣無瘤黏膜組織，離體后迅速置于液氮，存于-80℃?zhèn)溆谩?8例患者年齡35歲-84歲，平均63.64±10.77歲；男性15例，女性13例；結(jié)腸10例，直腸18例；未侵及漿膜16例，侵及漿(外)膜及以外12例；中高分化24例，低分化4例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例；無遠處轉(zhuǎn)移19例，發(fā)生包括肝轉(zhuǎn)移、脈管瘤栓、大網(wǎng)膜、腹膜、神經(jīng)及卵巢轉(zhuǎn)移共計9例；CEA<20 ng/ml共20例，CEA≥20 ng/ml共8例；CA199<40 U/ml共23例，CA199≥40 U/ml共5例；CA724<5 U/ml共25例，CA724≥5 U/ml共3例。所有患者術(shù)前未接受任何放化療，術(shù)后經(jīng)兩位副主任病理醫(yī)師證實符合WHO結(jié)直腸腺癌診斷標準。

1.2 試劑與儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-Time PCR試劑盒等購買于Takara寶生物工程大連有限公司，U6、miR-376a引物合成、實時熒光定量PCR儀購買于美國Thermo Fisher Scientific；PCR基因擴增儀T100購買于美國BIO-RAD。

1.3 組織總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6為內(nèi)參進行實時定量PCR反應(yīng)測定miR-376a CT值，利用公式計算ΔΔCt值,計算2-△△Ct值，即為實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析，部分數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，數(shù)據(jù)均以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，配對數(shù)據(jù)采用Wilcoxon檢驗方法，非配對數(shù)據(jù)采用Manny-Whitney檢驗方法，結(jié)果以P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-376a在結(jié)直腸癌組織中表達

miR-376a在結(jié)直腸癌組織和切緣處無瘤組織中的相對表達水平中位數(shù)和四分位數(shù)間距見表1。與無瘤黏膜組織比較，結(jié)直腸癌組織中miR-376a表達顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2 miR-376a與結(jié)直腸癌組織臨床病理特征之間的關(guān)系

miR-376a的相對表達量的中位數(shù)和四分位數(shù)間距與臨床病理特征之間的關(guān)系見表2。提示，miR-376a在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中表達低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的組織，在腫瘤標志物CEA高于20的患者中表達低，差異具有統(tǒng)計學意義。miR-376a的表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位、浸潤深度、分化程度、病理類型、腫瘤標志物(CA199 、CA724)無明顯關(guān)聯(lián)。

表1 miR-376a在結(jié)直腸癌和切緣無瘤黏膜組織中的相對表達水平

注：miR-376a表達量為中位數(shù)(四分位數(shù)間距)，下同。

表2 miR-376a相對表達量與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系

3 討論

MicroRNA(miRNA)是一段有18-25個核苷酸的短鏈非編碼RNA，它代表了一類內(nèi)源性表達的小RNA,能夠通過結(jié)合靶標mRNA的3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)域在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達[6-8]。目前關(guān)于miR-376a表達及其與臨床病理特征之間的關(guān)系尚無研究，因此，本論文分析結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和其切緣無癌黏膜組織中miR-376a的表達水平及其與結(jié)直腸癌的不同病理特征之間的關(guān)系。

miR-376a是miR-376家族成員之一，miR-376家族在腫瘤的形成和進展過程中發(fā)揮作用。結(jié)直腸癌組織中miR-376a的表達水平與無瘤黏膜組織比較，顯示結(jié)直腸癌組織中miR-376a表達顯著下調(diào)，提示miR-376a作為抑癌基因在結(jié)直腸癌中起重要作用。雖然大部分的研究顯示miR-376a是促癌miRNA，但是也有報道提出miR-376a表達增高抑制前列腺癌的進程和抑制肝癌細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，而神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者血清miR-376a表達水平明顯低于健康對照者，說明miR-376a在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用非常復(fù)雜。

Yang Liu等[5]人的研究顯示，miR-376a在卵巢癌組織中表達增高，與正常對照比較，晚期卵巢癌患者血清中miR-376a表達水平明顯高于未患卵巢癌的正常人，進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-376a通過調(diào)控Krueppel樣因子15和Caspase-8影響卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為。結(jié)直腸癌組織中miR-376a與KLF15和Caspase-8及凋亡相關(guān)蛋白之間的聯(lián)系值得深入研究。本文研究發(fā)現(xiàn)miR-376a在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中表達低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的組織，在腫瘤標志物CEA高于20 ng/ml的患者中表達低，差異具有統(tǒng)計學意義。miR-376a的表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位、浸潤深度、分化程度、病理類型、腫瘤標志物(CA199、CA724)無明顯關(guān)聯(lián)。因此推測miR-376a可能作為抑癌因子在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑制腫瘤生成的作用，并抑制了結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程。鑒于miR-376a在腫瘤患者的腫瘤組織及血清中表達明顯異常，深入研究miR-376a的表達變化對于結(jié)直腸癌的診斷、治療及預(yù)后判斷起到重要作用。

綜上，miR-376a作為抑癌因子在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中密切相關(guān)，需收集更多的標本深入驗證miR-376a與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系。同時，我們也將分析血清中miR-376a表達水平與結(jié)直腸癌診斷、分型、治療、預(yù)后等臨床病理特征之間的關(guān)系，為開發(fā)miR-376a成為結(jié)直腸癌無創(chuàng)診斷及治療的靶標提供依據(jù)。

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ExpressionofmicroRNA376aincolorectalcanceranditsconnectionwithclinicalsignificance

WANGJin-yan,ZHANGZhi-yong,ZHANGXue-ming,etal.

(TangshanGongrenHospital,Tangshan063000,China)

ObjectiveTo explores the expression of microRNA376a in colorectal cancer and the adjacent tumor free normal mucosa tissues,and analyze the relationship between expression of miR376a and clinic pathological features.Methods28 colorectal cancers and the adjacent tumor free normal mucosa tissues were obtained.Real time PCR was used to detect the expression of miR-376a;Relationship between relative expression of miR-376a and clinic pathological features of patient was analyzed.ResultsThere was a significant increase in miR-376a expression in colorectal cancers.The expressions of miR-376a were lower in with lymph node metastasis ,with distant metastasis and patients with CEA more than 20.ConclusionAs a cancer inhibitor,miR-376a inhibits formation of colorectal cancers and the invasion of colorectal cancer.

Colorectal cancer;Micro RNA-376a;clinic pathological features

河北省科技支撐計劃項目(142777101D)；唐山市科技創(chuàng)新團隊培養(yǎng)計劃項目(16130207B)

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1305-03

R735.3+5 R735.3+7

：A

王金艷(1982-),女,碩士,主治醫(yī)師，主要從事肛腸疾病的診治。

2017-07-19)