木薯鈣調蛋白的原核表達及其單克隆抗體的制備

歐文軍，余厚美，安飛飛，羅秀芹，秦于玲，陳松筆(中國熱帶農業科學院 熱帶作物品種資源研究所/農業部木薯種質資源保護與利用重點實驗室，海南儋州 571737)

木薯鈣調蛋白的原核表達及其單克隆抗體的制備

歐文軍，余厚美，安飛飛，羅秀芹，秦于玲，陳松筆
(中國熱帶農業科學院 熱帶作物品種資源研究所/農業部木薯種質資源保護與利用重點實驗室，海南儋州 571737)

鈣調蛋白(CaM)作為重要的抗逆信號轉導蛋白，在調控木薯抗逆境和塊根采后生理腐爛中起重要作用，為給快速檢測木薯在不同生長環境中CaM蛋白的表達水平提供優良抗體，克隆木薯CaM基因并將目的基因插入原核表達載體，經Escherichiacoli表達并純化，用純化的融合蛋白ACP-CaM免疫Balb/C小鼠，間接ELISA測定小鼠血清效價后，取小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合，篩選能產生抗CaM單克隆抗體的雜交瘤細胞株，用Western blot、ELISA等方法對制備的單克隆抗體進行初步鑒定。Western blot分析結果顯示原核表達重組質粒在E.coli中能高效表達CaM，免疫小鼠后取效價高的2#小鼠脾細胞和SP2/0細胞融合，共獲得7株效價均達到106以上、能穩定分泌抗CaM抗體的細胞株，這7 株單抗與淀粉磷酸化酶、His、BSA均無交叉反應，4D5株與標簽蛋白ACP有交叉反應，表明其余6株均為CaM特異性抗體；抗體亞型鑒定結果顯示7株單抗均為IgG型抗體。

木薯；鈣調蛋白；原核表達；單克隆抗體

木薯(ManihotesculantaCrantz)是世界三大薯類作物之一，也是世界六大農作物之一，是全球超過8億人的基本食糧。但木薯塊根采后2～3 d就快速腐爛，限制木薯的使用并導致嚴重的經濟損失[1-3]。對木薯采后腐爛的研究結果顯示，貯存木薯的塊根腐爛是一個復雜的蛋白質群協同調控過程，其影響因素包括抗氧化作用、碳水化合物及皮層能量代謝、細胞結構、信號轉導、氨基酸代謝、蛋白質生物合成等[2,4]。通過Pathway Studio軟件構建差異蛋白調控網絡，分析‘華南5號’木薯塊根差異蛋白群體在整個調控網絡中的關系，結果表明，NADH-氧化酶表達上調產生大量ROS，誘導鈣調蛋白(Calmodulin,CaM)上調，啟動一系列的生物防御反應，提高抗逆蛋白質表達，從而延長塊根貯藏時間，推測CaM在木薯塊根采后腐爛中起重要的調節作用[2,4]。

CaM 是廣泛存在于各種真核生物細胞中的多功能信號系統調控蛋白，為Ca2+的受體蛋白，雖然參與生物體多種生理活動調控，但它本身不具有酶活性，通過與相應靶蛋白結合發揮生物學效應，引起生物學活性改變參與鈣離子相關代謝活動的調控[5]，對生物體內多種Ca2+依賴的細胞功能和酶體系都有重要的調節作用，且能敏感捕獲任何微量的鈣[6]。CaM 在真核細胞的進化過程中高度保守，甚至在脊椎動物中具有完全相同的一級結構；在植物中，CaM的一級結構相似程度也在 90%以上[7]，更低級生物中的序列差異越來越大[8]。研究者們已經從不同植物，如小麥、苜蓿、番茄、水稻、擬南芥、馬鈴薯、扶桑等植物中分離或克隆得到CaM基因[8]。不同植物中存在多種CaM基因表達系統，擬南芥在水分噴射、地下灌溉、機械觸動和黑暗等4種外界刺激下，至少啟動 4 種CaM基因的表達，刺激 30 min后，CaM的表達水平增加近百倍。但用不同激素刺激，發現CaM的mRNA在大麥糊粉層原生質體細胞質和細胞核中表達沒有明顯變化，表明激素處理不會影響 CaM 的分布[8]。不同生物或非生物刺激，如病蟲害[9-11]、缺氧[12]、高鹽[13-14]、重金屬[15]和溫度[16]脅迫等，可以改變植物CaM基因的表達分布，只是在不同組織和器官中的含量和分布不同[8]。作為抗逆信號轉導中重要的蛋白，研究 CaM 含量在不同木薯品種、不同器官和不同時期的含量變化非常必要。筆者首次從木薯中克隆得到CaM基因，體外表達 CaM 蛋白，免疫小鼠制備其單克隆抗體，為快速檢測 CaM 在木薯不同品種(系)、不同器官和不同時期的分布和含量變化提供優良抗體，也可為木薯采后生理腐爛調控機制的研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

限制性內切酶、TaqDNA聚合酶、DNA連接酶、Marker等均購自北京索萊寶公司；質粒、E.coli來自國家菌種保藏中心；PEG融合劑、小鼠抗體亞型鑒定試劑盒、酰基載體蛋白質(Acyl Carrier Protein,ACP)、淀粉磷酸化酶(Starch phosphorylase,SP)、組氨酸(Histidine,His)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)為Sigma公司產品；QuickAntibody-mouse 5w佐劑、Clone easy培養基購自北京博奧龍免疫技術有限公司；HRP-羊抗鼠、DMEM不完全培養基、L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素、胎牛血清、小牛血清、HAT、HT、DMSO購自GIBCO公司；吐溫-20(Tween-20)、Triton X-100、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氯化鉀、甘油、丙酮、無水乙醇等化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司；ACP單克隆抗體為北京義翹神州生物技術有限公司產品；Babl/C小鼠購自汕頭大學醫學中心；SP2/0保存于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所農業部木薯種質資源保護與利用重點實驗室(以下簡稱“本實驗室”)；‘華南5號’木薯保存于農業部國家木薯種質資源圃；淀粉磷酸化酶為本實驗室原核表達；KJ-2為本實驗室在pET-16b的EcoRⅠ酶切位點后插入ACP-tag后改造得來。試驗于2015年3月-2016年6月進行。

1.2 方 法

1.2.1 KJ-2-CaM重組質粒的構建 根據Phytozome database(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Mesculenta) cassava4.1_018409m 數據庫的CaM基因序列設計引物，預期擴增產物長度為450 bp；上游引物ACP-CaM-F：5′-CGCggatccATGGCGACTCAATTCAGCGC-3′； 下游引物ACP-CaM-R：5′-CCGctcgagTTTCGCCATCATTAC TTTCACAA-3′(小寫部分為酶切位點)，在上下游引物中分別引入酶切位點BamHⅠ/XhoⅠ，以‘華南5號’木薯塊根cDNA為模板，將PCR擴增的目的片段回收后，與表達載體KJ-2分別用BamH I/XhoI雙酶切，回收，連接，取少量連接產物轉入大腸桿菌 DH5 α感受態細胞，接種至LB卡那霉素抗性固體培養基并37 ℃培養過夜，挑取單克隆至卡那霉素LB液體培養基，37 ℃ 、200 r/min培養過夜，取質粒進行測序鑒定，將鑒定正確的質粒命名為KJ-2-CaM。

1.2.2 融合蛋白的原核表達、鑒定與純化 將測序正確的質粒KJ-2-CaM轉化到宿主菌E.coliBL21中，用1.0 mmol/L IPTG誘導表達，收集菌體用超聲波破菌儀裂解，離心，分別收集上清和沉淀并進行分析。沉淀用8 mol/L 尿素變性增溶， Ni-NTA親和柱分離純化目的蛋白。純化蛋白依次在濃度為6、4、2、1、0.25、0.1、0 mol/L的尿素溶液中透析復性，每個濃度中透析12 h，復性蛋白分裝后 20 ℃凍存，備用。取50 L純化蛋白加入等體積2×SDS凝膠上樣緩沖液，100 ℃煮沸和冰浴各處理4 min，室溫10 000 r/min離心5 min，取20 μL進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色檢測純化效果。采用Western blot以1∶1 000 稀釋的抗 ACP 標簽單克隆抗體檢測重組蛋白的反應原性。

1.2.3 CaM單克隆抗體的制備 將純化后的融合蛋白ACP-CaM 按每鼠50 g的劑量與QuickAntibody-mouse 5w佐劑等劑量混勻，后腿肌肉注射免疫5只小鼠，第21 天按同樣方式再免疫 1 次，第35 天斷尾采血，全血37 ℃ 放置 2 h后4 ℃ 放置12 h，4 ℃ 10 000 r/min 離心15 min，收集血清，以純化后的融合蛋白ACP-CaM作為包被原，ELISA間接法檢測血清效價。取50 g 純化后的融合蛋白ACP-CaM用生理鹽水定容至500 L，腹腔沖擊免疫抗體效價高的小鼠，沖擊免疫后72 h 左右摘眼球取全血分離血清保存，備用。將小鼠在φ=75% 酒精中浸泡10 min，無菌條件下取出小鼠脾臟并分離脾細胞，與 SP2/0 細胞在 PEG 作用下融合，HAT 篩選培養，培養7～10 d后用間接ELISA 檢測細胞上清，陽性細胞用有限稀釋法克隆直至陽性單克隆率為 100%，小鼠體內誘生腹水法制備抗體，將陽性雜交瘤細胞于液氮中長期保存。

1.2.4 腹水純化 將新采集的腹水4 ℃、10 000 r/min離心15 min，去沉淀，用0.5 mol/L、pH 7.0的PBS 5倍稀釋，在冰浴條件下等體積逐滴加入飽和硫酸銨溶液，冰浴攪拌30 min后4 ℃靜置12 h，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀用與腹水等體積的0.02 mol/L、pH 7.2 的PBS溶解，冰浴條件下再逐滴加入總PBS體積半量的飽和硫酸銨溶液使之達到33%飽和度，連續攪拌30 min后，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀用0.02 mol/L、pH 7.2 的PBS透析72 h后分裝， 20 ℃凍存。

1.2.5 抗體鑒定 抗體特異性檢測：采用棋盤法測定抗體效價，即將純化的融合蛋白ACP-CaM用pH 9.6、0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液稀釋，按照250 ng/mL、500 ng/mL、1 g/mL、2 g/mL的質量濃度梯度包被酶標板，每孔100 μL，37 ℃ 包被2 h，每孔120 μL(含φ=5% 小牛血清的PBST)，37 ℃封閉1.5 h，每孔加100 μL梯度稀釋的抗體，37 ℃反應30 min，PBST洗滌 4～5 次，每孔加100 μL酶標羊抗鼠二抗，37 ℃反應30 min，PBST 洗滌4～5 次，TMB底物液37 ℃顯色反應15 min，0.5 mol/L H2SO4終止反應后酶標儀檢測每孔的吸光度(OD)。選擇陽性OD值大于陰性OD值2.1倍的抗體最高稀釋倍數為抗體的效價。然后分別在酶標板上包被1 g/mL ACP-CaM、ACP、SP、His、BSA，采用ELISA方法檢測抗體的特異性。

抗體亞型鑒定：用小鼠抗體亞型鑒定試劑盒檢測7株單抗的亞型。

抗體的應用：取‘華南5號’鮮薯塊根1 g，液氮中研磨，用丙酮沉淀法提取塊根蛋白，金屬浴10 min后13 000 r/min室溫高速離心取上清，得木薯塊根CaM蛋白初提液，CaM蛋白初提液SDS-PAGE后轉移至 NC 膜，用 5 g/L脫脂奶粉的 PBST 室溫封閉 2 h；加 1∶2 000 稀釋的抗CaM單克隆抗體室溫輕搖作用 1 h；PBST 洗滌 3 次；加入 1∶3 000 稀釋的 AP 標記羊抗鼠 IgG 室溫反應 1 h，再PBST 洗滌 3 次；BCIP/NBT 底物顯色。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建

PCR法從木薯塊根基因中獲得CaM基因片段，經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后450 bp的目的條帶清晰可見(圖1)，片段大小與預期相同，提取的陽性克隆質粒經測序鑒定證實序列準確。

M.Marker;1. PCR回收片段 PCR recovered fragments

2.2 Western blot分析

將KJ-2-CaM質粒轉化至E.coliBL21感受態細胞。1.0 mmol/L IPTG誘導5 h，經12% 分離膠SDS-PAGE，誘導后的菌液樣品在相對分子質量約為21 ku 處出現目的條帶，未經誘導的菌液上清樣品則無相應條帶(圖2)。說明目的蛋白在E.coliBL21中獲得表達，且以包涵體表達，主要存在于沉淀中。表達產物的Western blot結果表明(圖3)，印跡條帶約在21 ku處，說明蛋白表達成功。

M.Marker;1.上清液 Supernatant; 2.表達上清液 Expression supernatant; 3.包涵體 Inclusion

圖2CaM蛋白的SDS-PAGE檢測
Fig.2DetectionofCaMexpressionusingSDS-PAGE

M.Marker;1.表達上清純化產物 Expression supernatant purified product； 2.上清液 Supernatant

圖3CaM蛋白的Westernblot檢測
Fig.3DeterminationofCaMexpressionusingWesternblot

2.3 小鼠血清效價檢測

用免疫前的小鼠血清作為陰性對照，抗原包被2 g/mL，5只小鼠血清分別梯度稀釋，得到5只小鼠血清效價(圖4)，挑選效價高的2#小鼠進行細胞融合。

圖4 小鼠血清的效價Fig.4 Detection result of serum titer of mice

2.4 抗體純化后效價、亞型測定和特異性測定

融合后的雜交瘤細胞經過2～4次的有限稀釋克隆，得到7株陽性單克隆細胞(表1)，7株陽性單克隆細胞體外誘導法制備的腹水效價均達到106及以上，抗體亞型均為IgG型。所有抗體均與SP、His、BSA無交叉反應，4D5株與載體ACP有交叉反應，說明4D5株細胞產生的抗體為標簽蛋白特異性抗體，其余6株為CaM的特異性抗體。

表1 純化后的腹水效價和抗體亞型Table 1 Ascites titer and subtypes testing after purified

2.5 單克隆抗體的應用

丙酮沉淀法提取‘華南5號’鮮薯塊根CaM蛋白，經Western Blot分析，結果如圖5所示，木薯塊根樣本所在的1～3泳道在16.7 ku處有明顯印跡條帶，而無關蛋白BSA泳道未出現明顯條帶，說明該抗體能和木薯中CaM蛋白特異性結合，具有良好的反應原性。

M.Marker;1～3. 木薯塊根蛋白質 Proteins extracted from cassava storage root; 4. BSA

圖5Westernblot檢測木薯塊根中CaM的表達
Fig.5CaMexpressionoftuberousrootsincassavaSC5usingWesternblot

3 討 論

免疫學分析技術已廣泛應用于生命科學的各個研究領域，如人類臨床診斷中早孕HCG測試[17-18]、乙肝檢測[19-21]、腫瘤檢測[22]、動物疾病診斷[23-24]、食品安全檢測[25-28]等領域。隨著木薯全基因組測序工作的完成及基因數據庫的構建[29]，免疫學技術結合蛋白質組學的研究在木薯高效、高產、特用育種和關鍵蛋白表達調控機制研究通路中的應用將會越來越重要[1]。

目前，CaM的測定方法主要有免疫學方法、凝膠電泳法和酶法[5]。凝膠電泳法因檢測不準確應用較少；酶法能檢測有活性的CaM，但是測定過程中容易受到干擾而導致測定值偏低；免疫學方法主要有放射免疫分析法(RIA)和酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，這2種方法檢測都是以抗原抗體特異性結合為基礎，兩者都需要制備CaM抗體[5]。免疫學檢測方法特異性強，受待測樣本中非CaM成分干擾相對小，能檢測CaM總量，但是不能確定CaM活性含量[30]。

CaM是由148個氨基酸殘基組成的小分子蛋白，由于其一級結構在進化上高度保守，抗原表位較少，用常規方法極難制備出特異性強的優質抗體[30]。本試驗以木薯為研究對象，成功表達木薯CaM融合蛋白，免疫小鼠制備單克隆抗體。由于是用重組表達的ACP-CaM免疫小鼠制備單克隆抗體，小鼠的B細胞中有可能存在抗標簽蛋白ACP的抗體，并且單抗制備整個過程也是用ACP-CaM作為包被原來篩選特異性抗體，難免會有單克隆細胞株產生的抗體是針對標簽蛋白的，所以在后期進行特異性篩選時，用ACP直接包被ELISA板，檢測其和單克隆抗體是否結合，排除1株單克隆細胞株，其余為CaM特異性單克隆抗體。

作為獲得單克隆抗體細胞株最關鍵的一步就是細胞融合，影響細胞融合效率的因素包括SP2/0細胞形態和數量、脾細胞數量、融合時間、融合劑等，為得到更高的融合率，SP2/0在融合前2周復蘇，再用8-氮鳥嘌呤處理1周以上，將細胞培養到形態最好的對數生長期再進行融合。培養更多的SP2/0，使融合時B細胞的選擇更多，融合成功率大。分離脾細胞后，2 000 r/min離心10 min，雖然相對其他報道，這個轉速較高，但是可以獲得更多的B細胞，能提高融合的成功率。

在雜交瘤細胞制備過程中，細胞融合、克隆和擴大培養階段都加入不同濃度含細胞生長因子的飼養細胞替代品Clone easy，以減少制備腹腔細胞作為飼養細胞試驗過程中帶來的污染以及不殺小鼠取腹腔巨噬細胞體現的動物福利。本研究制備6株能穩定分泌抗CaM蛋白的單克隆雜交瘤細胞株所產生的抗體，為快速檢測木薯中不同品種(系)、不同形成時期、不同部位的CaM含量提供優質抗體，有利于Ca2+作為信號分子和Ca2+-CaM復合系統在整個木薯生長發育和塊根采后生理代謝中的機制研究。

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ProkaryoticExpressionandMonoclonalAntibodyPreparationofCalmodulinOriginatedfromCassava

OU Wenjun,YU Houmei,AN Feifei,LUO Xiuqin,QIN Yuling and CHEN Songbi
(Tropical Crops Genetic Resources Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences /Key Laboratory of Ministry of Agriculture for Germplasm Resources Conservation and Utilization of Cassava,Danzhou Hainan 571737,China)

Calmodulin(CaM) is an important signal-transduction protein. It will play an important role in regulating tolerance to extreme conditions and postharvest physiology deterioration. In order to provide good antibody in rapid determination of CaM expression in cassava growing at different environments,in the present study,cDNA of cassava CaM was cloned into the prokaryotic expression vector,CaM was expressed inE.coliand then purified. The purified fusion protein ACP-CaM was used to immunize Balb/c mice and the titer of mice serum was determined by indirect ELISA. The spleen lymphocyte was fused with SP2/0 hybridoma to produce monoclonal antibody against CaM. Western blot and ELISA were carried out to preliminarily identify the monoclonal antibody produced by these hybridomas. Western blot result showed that recombinant plasmid inE.colican expressed CaM efficiently. SP2/0 cells and spleen cells of 2# mice were fused,then 7 strains,which antibody titer was more than 106,were

,no cross reaction with starch phosphorylase,His and bovine serum albumin. 4D5 strains has cross reaction with carrier protein ACP,6 strains of CaM were specificity antibodies. All of strains were IgG type.

Cassava(ManihotesculantaCrantz); Calmodulin; Prokaryotic expression; Monoclonal antibody

2016-08-03

2016-11-10

Central Public-interest Scientific Institution Basal Research(No. 0315014); NSFC-CGIAR International(Regional) Cooperation and Exchange Programs(No.31361140366);Chinese Cassava Agro-technology Research System(No.CARS-12).

OU Wenjun,male,associate researcher,Ph.D.Research area:cassava germplasm resources. E-mail：cassava6973@163.com

Q94-336

A

1004-1389(2017)09-1317-07

(責任編輯：顧玉蘭Responsibleeditor:GUYulan)

西北農業學報 2017，26(9)：1324?1333ActaAgriculturaeBoreali?occidentalisSinicadoi：10．7606/j．issn．1004-1389．2017．09．009

日期：2017-09-12

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170912.1740.018.html

2016-08-03

2016-11-10

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(0315014)；NSFC-CGIAR國際合作重點項目(31361140366)；現代農業產業技術體系專項資金(CARS-12)。

歐文軍，男，副研究員，博士，研究方向為木薯種質資源。E-mail：cassava6973@163.com

陳松筆，男，研究員，研究方向為木薯蛋白質組學和作物遺傳育種。E-mail：songbichen@catas.cn

CorrespondingauthorCHEN Songbi,male,research fellow.Research area:cassava proteomics and crop genetics and breeding. E-mail: songbichen@catas.cn