產復合酶優良菌株篩選及蘋果渣固態發酵效果研究

2017-09-25 06:09:29李海洋韋小敏來航線黨妮娜王昕昱孔令昭聶榮杰劉壯壯西北農林科技大學資源環境學院陜西楊凌712100

西北農業學報 2017年9期

李海洋，李肖，韋小敏，來航線，黨妮娜，王昕昱，孔令昭，聶榮杰，劉壯壯(西北農林科技大學資源環境學院，陜西楊凌 712100)

李海洋，李肖，韋小敏，來航線，黨妮娜，王昕昱，孔令昭，聶榮杰，劉壯壯
(西北農林科技大學資源環境學院，陜西楊凌 712100)

通過液態發酵產酶試驗和蘋果渣固態發酵試驗，研究不同絲狀真菌產水解酶的活性及產酶優良的霉菌對蘋果渣發酵的改質效果，篩選出適用于蘋果渣發酵的優良霉菌。結果表明，黑曲霉MHQ1產纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶的活性較高，分別為64.7、66.9和216.7 U·mL-1；米曲霉MMQ1產淀粉酶和蛋白酶的活性較高，分別為1 782.6 和83.0 U·mL-1；煙曲霉MYQ1產蛋白酶和果膠酶的活性較高，分別為128.9 和51.6 U·mL-1。其中，黑曲霉MHQ1能在果渣基質上良好地生長，對果渣具有較強的降解改質能力，產物中粗蛋白和純蛋白質量分數分別增至387.5 和228.9 g·kg-1，接菌增率為79.2%和193.8%，且纖維素酶、果膠酶和蛋白酶的活性分別為178.0、150.6和57.5 U·g-1，纖維素、果膠分別降解28.9%、53.8%，水溶性氨基酸質量分數增至2.7%。采用酵母菌與產復合酶優良的霉菌復合發酵，能顯著提高果渣發酵產物中的蛋白質水平，降低抗營養物質的質量分數，提高水解酶和水溶性氨基酸等活性物質的質量分數，有效地發酵果渣為生物蛋白飼料。

霉菌；水解酶；蘋果渣；固態發酵；蛋白質；

中國是重要的蘋果生產國，年產蘋果約為2 500 萬t[1]。蘋果加工過程中每年約有100多萬t蘋果渣產生[2]，因此，對其充分開發利用成為許多學者的重要研究課題。隨著中國飼料工業和畜牧業的迅速發展，尋找開發非常規蛋白飼料原料已成為飼料工業和養殖業急需解決的問題[3-5]。蘋果渣因含有可溶性糖、維生素、礦物質、氨基酸等多種營養物質[6]，越來越多地被應用于動物飼料。但果渣中較低的蛋白質質量分數、較大的酸度和果膠、纖維素等抗營養因子的存在，直接影響果渣作為飼料的飼用效果[7-8]。通過外源氮素的添加，利用微生物的分解再合成過程提高果渣中蛋白質的質量分數，是實現果渣飼料化利用的重要措施，研究[9-10]表明，采取多種菌種混合發酵可有效提高產物中營養物質的質量分數，且生產上常用協同性和互補性較好的霉菌與酵母組合作為發酵菌劑。主要因為微生物發酵過程是復合酶水解原料中大分子營養物質的過程，酶的活力及酶的復合類型決定菌劑對底物的降解改質程度。有鑒于此，本研究通過液態發酵產酶試驗探究不同絲狀真菌的產酶活性及產酶類型，再將產復合酶活性較高的霉菌與酵母配伍，進行果渣復菌發酵，以期獲得用于蘋果渣固態發酵生產生物蛋白飼料的專適性霉菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種黑曲霉MHQ1(AspergillusnigerMHQ1)、黑曲霉MHQ2(AspergillusnigerMHQ2)、黑曲霉MHQ3(AspergillusnigerMHQ3)、黑曲霉MHQ4(AspergillusnigerMHQ4)、米曲霉MMQ1(AspergillusoryzaeMMQ1)、米曲霉MMQ2(AspergillusoryzaeMMQ2)、煙曲霉MYQ1(AspergillusfumigatesMYQ1)、瑞氏木霉MRM1(TrichodermareeseiMRM1)，未知菌株MW1、MW2 、MW3 、MW4、MW5。以上菌種均由西北農林科技大學資源環境學院微生物資源研究室提供。

長枝木霉13003(Trichodermalongibrachiatum13003)、綠色木霉13002(Trichodermaviride13002)、酵母菌為產朊假絲酵母1314 (Candidautilis1314)均購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 原料烘干蘋果渣由眉縣恒興果汁有限公司提供，油渣、麩皮均購自市場。

1.1.3 培養基絲狀真菌培養基為馬鈴薯瓊脂培養基(PDA)，酵母培養基為YEPD培養基[11]。

液體發酵培養基：麥秸粉15 g，麩皮20 g，微晶纖維素6 g，豆餅粉5 g，硫酸銨2 g，尿素1 g，硝酸鈉2 g，硫酸二氫鉀3 g，硫酸鎂0.5 g，吐溫80 3 mL，自來水1 000 mL，pH自然。

固態發酵原料：原料為w(蘋果渣)∶w(油渣粉)∶w(尿素)=17∶2∶1。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備絲狀真菌孢子懸液：將28 ℃活化的霉菌斜面菌種用無菌水配制成菌懸液，接種至裝有滅菌PDA固體培養基的三角瓶中，28 ℃培養72 h后加入200 mL無菌生理鹽水，搖動制成孢子懸液，采用血球計數法測定孢子數，并用無菌水稀釋至108cfu·mL-1。

酵母菌懸液：按照無菌操作法向100 mL滅菌YEPD液體培養基中接入產阮假絲酵母菌，28 ℃、150 r·min-1搖瓶培養72 h，采用血球計數法測定細胞數，并用無菌水稀釋至108cfu·mL-1。

1.2.2 絲狀真菌液態發酵準確量取80 mL液體發酵培養基于500 mL抽濾瓶中，121 ℃濕熱滅菌30 min。待培養基冷卻后，通過打孔法分別將15株絲狀真菌的產孢子菌塊接入抽濾瓶中，每瓶接3塊，共設16個處理，為對照(CK)和單接各個絲狀真菌MHQ1、MHQ2、MHQ3、MMQ1、MW1、MHQ4、MYQ1、13003、MMQ2、MRM1、MW2、 MW3、MW4、13002、MW5，每處理重復3次。將接種后搖勻的液態培養基置于28 ℃恒溫、200 r·min-1振蕩培養5 d，從第2天起每天定時取樣，獲得含酶發酵液，發酵液經5 000 r·min-1離心和真空抽濾即為去除菌體的粗酶液，酶液4 ℃保存，備用。

1.2.3 固態發酵準確稱取固態發酵原料50 g裝入650 mL組培瓶，加入75 mL mandels復合鹽溶液，混勻，121 ℃濕熱滅菌30 min。待培養基冷卻后，按單一霉菌分別與酵母配伍的方式，在每瓶培養基中接入3 mL酵母菌懸液和3 mL霉菌孢子懸液，共設7個處理，為對照(CK)、酵母菌+黑曲霉組(Y+MHQ1)、酵母菌+米曲霉組(Y+MMQ1)、酵母菌+煙曲霉組(Y+MYQ1)、酵母菌+黑曲霉組(Y+MHQ3)、酵母菌+長枝木霉組(Y+13003)、酵母菌+未知霉菌組(Y+MW1)，每個處理重復3次。將接種并攪勻的培養基于28 ℃恒溫培養箱培養96 h，培養期間，每隔24 h觀察記錄培養基中絲狀真菌菌絲的生長情況，并記錄。培養結束后，將發酵樣品于40 ℃低溫烘干至恒量，冷卻后準確稱量并記錄，最后將樣品粉碎，過40目篩，備用。

1.2.4 測定方法纖維素酶活、木聚糖酶活、淀粉酶活和果膠酶的活性測定采用DNS法[12-14]；蛋白酶酶活的測定采用GB/T23527-2009，粗蛋白的測定采用GB/T 6432-1994，純蛋白的測定采用凱氏定氮法[15]；纖維素的測定采用GB/T20806-2006；果膠的測定采用果膠酸沉淀法[16]；水溶性氨基酸的測定采用茚三酮比色法[17]。

1.2.5 計算公式發酵產物得率=發酵產物干質量/發酵前原料干質量×100%

發酵增率 (△f)=(發酵產物營養物質質量分數-未發酵純蘋果渣營養物質質量分數)/未發酵純蘋果渣營養物質質量分數×100%

接菌增率(△i)=(接菌發酵產物營養物質質量分數-未接菌發酵產物營養物質質量分數)/未接菌發酵產物營養物質質量分數×100%

1.2.6 數據分析采用DPS 7.05軟件對數據進行統計分析，試驗結果以“平均數±標準差”表示，采用Duncan’s 新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 飼用復合酶優良絲狀真菌篩選

不同菌種產酶活性和類型不同，通過單一菌株液體發酵產酶試驗測定纖維素酶、蛋白酶、果膠酶、淀粉酶和木聚糖酶的活性，從而篩選出能產多種水解酶且酶活較高的優良絲狀真菌。

2.1.1 高產纖維素酶纖維素酶是一類能水解纖維素成簡單糖的復合酶，它主要包括葡聚糖內切酶(EG)、葡聚糖外切酶(CBH)和 β-葡萄糖苷酶(BG)。纖維素酶活性測定常用的可溶性底物為羧甲基纖維素，不溶性底物為新華1號濾紙，本研究以濾紙為底物測定大型絲狀真菌液態發酵產物中纖維素酶的活性，酶活結果見圖1。

由圖1可知，15株霉菌液體發酵5 d后，最高纖維素酶活變幅為6.1～64.7 U·mL-1，其中來源于中國工業菌種保藏中心產纖維素酶優良的長枝木霉13003菌株的酶活為30.0 U·mL-1。以菌株13003作為纖維素酶活參比菌株，可知酶活高達64.7 U·mL-1的黑曲霉MHQ1顯著優于13003和其他霉菌，可作為產纖維素酶的優良出發菌株。菌株MHQ2、MHQ3、MW2、MMQ1酶活都在20 U·mL-1以上，雖然較參比菌株酶活低，但都顯著高于其他霉菌。

柱狀圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同 Letters on histogram indicate significant difference (P<0.05),the same below

2.1.2 高產蛋白酶蛋白酶是作用于蛋白質或多肽，催化肽鍵水解的酶類。按蛋白酶水解蛋白質的最適作用 pH不同，可分為酸性、中性和堿性蛋白酶，飼料工業中使用的是酸性和中性蛋白酶。本研究在中性條件下測定霉菌液態發酵產物的中性蛋白酶活性，酶活結果見圖2。

由圖2可知，15株霉菌液體發酵后，最高蛋白酶活變幅為0.7～128.9 U·mL-1，其中MYQ1、MMQ1菌株產蛋白酶活性較高，酶活分別為128.9和83.0 U·mL-1，且菌株MYQ1、MMQ1酶活顯著高于其他霉菌(P<0.05)，可作為產蛋白酶的優良出發菌株。其次為菌株MW1、MW2、MW4、13002，酶活都在45 U·mL-1以上，且相鄰兩菌株間酶活差異不顯著，但都顯著高于菌株MHQ1、MHQ2、MHQ3、MHQ4、13003、MMQ2、MRM1。

圖2 15株絲狀真菌液態發酵產物中的蛋白酶活性Fig.2 Protease activity of 15 strains’ liquid fermentation products

2.1.3 高產果膠酶果膠酶是指能催化分解果膠質的一類酶的總稱，包括原果膠酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶和果膠酯酶等[18]。果膠酶以果膠為底物，可以使果膠分解并產生半乳糖醛酸。本研究采用DNS法測定霉菌液態發酵產物中的果膠酶活性，酶活結果見圖3。

由圖3可知，15株霉菌液體發酵后，最高果膠酶活變幅為20.8～66.9 U·mL-1，其中MHQ1菌株產果膠酶活性最高，其次為MHQ3、MYQ1、MW2菌株，果膠酶活力分別為66.9、55.5、51.6 和43.3 U·mL-1，且菌株MHQ1酶活顯著高于其他霉菌(P<0.05)，可作為產蛋白酶的優良出發菌株。菌株MHQ3、MYQ1、MW2酶活都在40 U·mL-1以上，且相鄰菌株酶活差異不顯著，但顯著高于其他菌株。

圖3 15株絲狀真菌液態發酵產物中的果膠酶活性Fig.3 Pectinase activity of 15 strains’ liquid fermentation products

2.1.4 高產淀粉酶淀粉酶是能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶[19]。

由圖4可知，15株霉菌液體發酵后，最高淀粉酶活變幅為129.9～1 782.6 U·mL-1，其中MMQ1菌株產淀粉酶活性最高，其次為MW1、MW3、MMQ2菌株，酶活分別為1 039.1、1 001.2和955.3 U·mL-1，且菌株MMQ1酶活顯著高于其他霉菌(P<0.05)，可作為產淀粉酶的優良出發菌株。菌株MW1、MW3、MMQ2酶活都在900 U·mL-1以上，且3株霉菌之間酶活無顯著差異，但都顯著高于其他菌株。

2.1.5 高產木聚糖酶木聚糖酶是一類降解木聚糖的復合酶系，主要有內切木聚糖酶、外切木聚糖酶、脫支鏈酶、木糖苷酶等。液態發酵產物中的木聚糖酶活性見圖5。由圖5可知，15株霉菌液體發酵后，最高木聚糖酶活變幅為49.2～224.3 U·mL-1，其中MHQ3、MHQ1菌株酶活較高，其次為菌株13003，木聚糖酶活力分別為224.3 、216.7和193.0 U·mL-1，且除13003菌株外，菌株MHQ3、MHQ1酶活顯著高于其他霉菌(P<0.05)，可作為產木聚糖酶的優良出發菌株。菌株13003酶活高于MHQ2、MMQ1、MW2，并顯著高于其他霉菌(P<0.05)。

圖4 15株絲狀真菌液態發酵產物中的淀粉酶活性Fig.4 Amylase activity of 15 strains’ liquid fermentation products

2.1.6 優良菌株的綜合產酶情況將15株霉菌按5種酶的活性高低進行排序，綜合各種酶活排序選取能產生多種酶且活性較高的霉菌為優良菌株，排序篩選結果見表1。

表1表明，絲狀真菌MHQ1、MMQ1、13003、MHQ3、MYQ1、MW1產復合酶的活性較高，尤以菌株MHQ1、MMQ1、MYQ1的表現最佳，其中霉菌MHQ1、MHQ3產纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶的活性較高，菌株MMQ1、MW1產蛋白酶和淀粉酶的活性較高，菌株13003產纖維素酶和木聚糖酶的活性較高，菌株MYQ1產蛋白酶和果膠酶的酶活較高。上述霉菌作為產復合酶優良菌株，可用于蘋果渣及其他有機渣類發酵試驗和進一步研究其對蘋果渣等有機廢棄物的酶解改質效果。

圖5 15株絲狀真菌液態發酵產物中的木聚糖酶活性Fig.5 Xylanase activity of 15 strains’ liquid fermentation products

表1 優良霉菌產5種酶活性的綜合排序Table 1 Comprehensive ranks of five enzyme activity produced by comparably high-enzyme yield strains

注：阿拉伯數字表示排序名次。

Note: Numbers in the table means the ranking numbers.

2.2復菌固態發酵對蘋果渣發酵產物中蛋白質量分數的影響

不同的產酶菌株對蘋果渣發酵基質的降解利用能力不同，將上述篩選的產復合酶活性較高的絲狀真菌與產朊假絲酵母1314復配，用于蘋果渣固態發酵，通過記錄和測定發酵產物中菌絲生長狀況、發酵飼料得率、粗蛋白質量分數和純蛋白質量分數，研究不同絲狀真菌與酵母組合對蘋果渣發酵效果的影響。

2.2.1 霉菌菌絲生長狀況發酵蘋果渣中菌絲的生長速度和數量反映菌絲的生長特性和對果渣發酵基質的適應程度，酵母菌與絲狀真菌混合發酵蘋果渣過程中菌絲的生長狀況見表2。

從表2可以看出，發酵原料在接種發酵劑后，菌絲體隨著生長時間增加不斷增長，且各處理菌體生長狀況因發酵劑不同稍有差異。接種24 h后，處理Y+MMQ1、Y+MHQ3、Y+MW1中出現白色菌絲；接種48 h后，Y+MHQ1、Y+MMQ1、Y+MHQ3處理基質中已呈現旺盛菌絲，表明霉菌MHQ1、MMQ1、MHQ3在果渣基質中能快速生長；接種72 h后，除Y+13003外，各接種處理基質中的菌絲生長繁茂，布滿發酵原料，結成白色團狀；而處理Y+13003在發酵96 h后才出現旺盛菌絲，表明上述6株霉菌均能在果渣基質中良好地生長，其中霉菌13003生長相對較慢。

表2 菌絲的生長狀況Table 2 Mycelium growth condition onfermenting apple pomace

注：“-”表示外觀無明顯變化，“+”表示菌絲開始生長，“++”表示菌絲明顯可見，“+++”表示菌絲生長旺盛。

Note: “-”means no significant change, “+”means beginning growth, “++”means clearly visible, “+++”means vigorous growth.

2.2.2 對發酵蘋果渣飼料粗蛋白質量分數的影響蘋果渣經過酵母菌與絲狀真菌復合發酵后，產物中粗蛋白質量分數及其增率見表3。

由表3可知，發酵能大幅提高果渣發酵產物中粗蛋白的質量分數，發酵產物粗蛋白質量分數為216.2～387.5 g·kg-1，較未發酵純果渣中粗蛋白質量分數增加262.1%～549.1%。其中，未接菌發酵產物中粗蛋白質量分數為216.2 g·kg-1，較純蘋果渣增加262.1%，主要是輔料的添加調節發酵果渣氮素的質量分數，同時在低溫烘干過程中可能伴有孢子飄散引起氮素的少量累積。與未接菌發酵相比，酵母與霉菌混合發酵能顯著提高發酵產物中粗蛋白的質量分數(P<0.05)，接菌增率為20.9%～79.2%。混菌處理Y+MHQ1發酵產物粗蛋白質量分數及其增率最高，分別為387.5 g·kg-1和79.2%，并顯著高于其他處理。混菌處理Y+MHQ3發酵產物粗蛋白質量分數及其增率分別為369.6 g·kg-1和70.9%，僅次于酵母與霉菌MHQ1的復合發酵效果。

表3 粗蛋白的質量分數及其增率Table 3 Increased percentages of crude protein mass fraction in fermentation products

注：未發酵純果渣原料粗蛋白質量分數為59.7 g/kg。下同。

Note: Mass fraction of crude protein in samples were 59.7 g/kg. The same below.

2.2.3 對發酵蘋果渣飼料純蛋白質量分數的影響蘋果渣經過酵母菌與絲狀真菌混合發酵后，產物中純蛋白質質量分數及其增率見表4。

由表4可知，發酵能大幅提高果渣發酵產物純蛋白的質量分數，發酵產物純蛋白質量分數為77.9～228.9 g·kg-1，較未發酵純果渣中純蛋白質量分數增加51.0%～343.6%。其中未接菌發酵產物中純蛋白質量分數為77.9 g·kg-1，較純果渣增加51.0%。與未接菌發酵相比，酵母與霉菌混合發酵能顯著提高發酵產物中純蛋白的質量分數(P<0.05)，接菌增率為31.2%～193.8%。混菌處理Y+MHQ1發酵產物純蛋白質量分數及其增率最高，分別為228.9 g·kg-1、193.8%，并顯著高于其他處理，表明在酵母菌的配伍下，霉菌MHQ1能有效改質果渣為生物蛋白飼料。

上述結果表明，產飼用復合酶優良的絲狀真菌均能利用蘋果渣基質良好地生長，能不同程度地提高發酵產物中粗蛋白和純蛋白的質量分數，其中黑曲霉MHQ1表現最佳，發酵后產物中粗蛋白和純蛋白質量分數分別達到387.5、228.9 g·kg-1。

表4 純蛋白的質量分數及其增率Table 4 Increased percentages of pure protein mass fraction in fermentation products

注：未發酵純果渣原料純蛋白的質量分數為51.6 g/kg。

Note: Mass fraction of pure protein in samples were 51.6 g/kg.

2.3黑曲霉與酵母配伍用于蘋果渣固態發酵的效果

黑曲霉MHQ1和產朊假絲酵母1314配伍的復合菌劑用于蘋果渣固態發酵，通過測定發酵產物中纖維素酶、果膠酶和蛋白酶活性及纖維素、果膠和水溶性氨基酸的質量分數，進一步探討該復合菌劑對蘋果渣的利用和改質效果，結果見表5。

由表5可知，優良黑霉菌株MHQ1與酵母菌復合發酵蘋果渣發酵產物中纖維素酶、果膠酶和蛋白酶的酶活分別為178.0、150.6和57.5 U·g-1，較純果渣分別增加867.4%、497.6%和168.7%。產物中纖維素和果膠質量分數分別為18.9%和4.8%，與純果渣相比纖維素、果膠降解率分別為28.9%、53.8%，純蛋白、水溶性氨基酸增至22.9%、2.7%，表明經過發酵酶解，蘋果渣中的纖維素和果膠發生不同程度的降解利用，減少飼料中抗營養物質的質量分數，同時水溶性氨基酸質量分數得到大幅提高，蛋白質部分轉化為更容易被動物吸收利用的氮素形態。

表5 纖維素酶、果膠酶、蛋白酶活性及部分營養物質的質量分數Table 5 Cellulase, pectinase and protease activity and nutrients mass fraction in fermentation products

3 討論與結論

近些年，產酶菌株的篩選主要集中在產單一酶活性較高菌株的篩選，通過選擇培養基分離篩選自然界中產酶活性較高的原生菌株。張歡[20]篩選出1株產纖維素酶活性較高的黑曲霉菌株，其發酵液濾紙酶活力和羧甲基纖維素酶活力分別達到40.7 和60.9 U·mL-1；魏丕偉等[21]從高溫大曲中獲得1株中性蛋白酶活11.0 U·mL-1的米曲霉；華寶玉等[22]從桔子園土壤和腐爛的水果等處篩選得到產果膠酶活可達42.0 U·mL-1的聚多曲霉；國春艷等[23]從土壤中篩選出液態發酵下木聚糖酶活高達 628.4 U·mL-1的黑曲霉菌株；肖長清等[24]報道1株大曲中降解淀粉能力較強的黑曲霉，液體發酵酶活可達35.0 U·mL-1。本研究通過液態發酵產酶試驗，綜合評價各菌株的酶活力，從15株霉菌中篩選出5株產復合酶活性較高的菌株，尤以菌株MHQ1、MMQ1、MYQ1表現優異。在統一酶活單位下比較可知，本研究篩選出的優良菌株的淀粉酶和蛋白酶活性優于文獻[21，24]報道的菌株，纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶與菌株酶活[20，22-23]相一致，且綜合產酶能力較好，可以做為飼用復合酶制劑生產的優良材料。

霉菌可以分泌豐富的水解酶類，且霉菌中菌體蛋白質的質量分數可達20%～30%，因此在蛋白飼料的生產中霉菌被廣泛使用[25]。陳娟等[26]利用黑曲霉與多株酵母菌復合發酵蘋果渣，產物中粗蛋白質量分數增至27.6%，提高455.3%。張高波等[27]研究表明，酵母與霉菌復菌發酵果渣后，產物中纖維素酶、蛋白酶活性分別為64.3和742.4 U·g-1，較對照增加947.4%和207.3%。與上述結果相似，本研究以酵母菌配伍產復合酶優良的霉菌進行果渣固態混菌發酵，結果表明黑曲霉MHQ1與產朊假絲酵母共發酵能顯著提高蘋果渣中粗蛋白和純蛋白的質量分數，明顯提高纖維素酶、果膠酶和蛋白酶的活性，降低纖維素和果膠的質量分數，發酵改質效果明顯。主要因為黑曲霉在果渣發酵過程中能產生多種水解酶，將果渣中的纖維素和果膠等降解為易利用的還原糖[28-29]，同時纖維素酶和果膠酶共同作用破壞細胞壁，有利于胞內淀粉、脂類、維生素等營養物質的釋放[30]，為酵母和霉菌的生長、蛋白質的累積提供充足的物質基礎；另一方面，酵母對可溶性營養物質的利用可以減弱纖維素酶等合成的反饋抑制作用，進一步提高產酶的效率[31]。因此，絲狀真菌與酵母良好的協同共生關系，為果渣等非常規飼料原料的開發利用開辟廣闊的前景。

本研究獲得1株產纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶活性較高，能用于蘋果渣發酵生產生物蛋白飼料的優良絲狀真菌黑曲霉MHQ1，其與產朊假絲酵母菌配伍發酵果渣，能顯著提升產物中蛋白的質量分數，增加纖維素酶、果膠酶和蛋白酶的活性，不同程度地降解纖維素、果膠等抗營養物質，有效地改質蘋果渣為生物蛋白飼料，為蘋果渣的飼料化利用提供優良出發菌株。

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ScreeningofHighYieldMultiEnzyme-ProducingStrainsandItsEffectonApplePomaceSolid-StateFermentation

LI Haiyang，LI Xiao，WEI Xiaomin，LAI Hangxian，DANG Nina，WAGN Xinyu，KONG Lingzhao，NIE Rongjie and LIU Zhuangzhuang
(College of Natural Resources and Environment，Northwest A&F University，Yangling Shaanxi 712100，China)

Several high enzyme-yield strains were screened through liquid fermentation and apple pomace solid state fermentation experiment by comparing the hydrolytic enzyme activity and product quality of apple pomace fermentation.The results showed that the activity of cellulose (64.7 U·mL-1), pectinase(66.9 U·mL-1) and xylanase (216.7 U·mL-1) produced byAspergillusnigerMHQ1 were comparably high, and the amylase(1 782.6 U·mL-1) and protease(83.0 U·mL-1) produced byAspergillusoryzaeMMQ1 were comparably high,and the activity of protease(128.9 U·mL-1) and pectinase (51.6 U·mL-1) produced byAspergillusfumigatesMYQ1 were comparably high. Among all,AspergillusnigerMHQ1 grew well on the apple pomace substrate, and fermenting combined with yeast could improve the products quality of apple residue fermentation: the crude protein and pure protein mass fraction of the products increased to 387.5 g·kg-1and 228.9 g·kg-1; the efficiency of seed inoculation was enhanced by 79.2% and 193.8% compared with blank samples, and the activities of cellulase, pectinase and protease were 178.0 U·g-1, 150.6 U·g-1and 57.5 U·g-1,respectively. Besides the anti-nutrients such as cellulose, pectin were degraded by 28.9% and 53.8%, and water soluble amino acid mass fraction increased to 2.7%. In all,AspergillusnigerMHQ1 fermentation with yeast could significantly improve protein level of fermentation product of apple pomace,reduced the anti-nutrient mass fraction, and increased the hydrolytic enzymes activity and the water soluble amino acids mass fraction.Therefore,AspergillusnigerMHQ1 combined with yeast, could effectively ferment apple pomace to biological protein-rich feed.

Mycete; Hydrolase; Apple pomace; Solid state fermentation; Protein

2016-04-29

2016-06-05

National Science & Technology Pillar Program of 12th Fve-year Plan(No.2012BAD14B11).

LI Haiyang, male,master student.Research area: microbial resources and utilization.E-mail:clisea@yeah.net

S816.6

1004-1389(2017)09-1301-10

(責任編輯：顧玉蘭Responsibleeditor:GUYulan)

日期：2017-09-12

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170912.1740.014.html

2016-04-29

2016-06-05