豬流行性腹瀉病毒陜西渭南株的遺傳變異

吳萌萌，許夏澎，張彥明，周宏超，郭抗抗(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

豬流行性腹瀉病毒陜西渭南株的遺傳變異

吳萌萌，許夏澎，張彥明，周宏超，郭抗抗
(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

從陜西省渭南某規(guī)模化豬場采集疑似豬流行性腹瀉(PED)仔豬病料進行病毒檢測，旨在從基因遺傳變異方面分析疾病發(fā)生的可能原因。通過RT-PCR從疑似仔豬20份小腸樣品中檢測到9份PED病毒陽性樣品，并擴增出PED病毒M、 ORF3和S基因的部分序列。序列分析結(jié)果表明，與CV777疫苗株對比，樣品渭南(WN)株P(guān)EDVM基因高度保守，同源性為98.2%； ORF3基因存在11處堿基突變，同源性為98.2%；S基因突變較大，存在4個插入?yún)^(qū)域，分別是164～166、177～179、181～186和416～418 nt，內(nèi)分核心中和表位區(qū)(COE，499～638位氨基酸)存在9個氨基酸突變位點。遺傳分析顯示，WN株M基因與中國近期分離毒株親緣關(guān)系較近； ORF3基因與同處在G1群中的中國毒株親緣關(guān)系較近，而與CV777疫苗株親緣關(guān)系較遠；S基因與中國早期分離毒株及CV777疫苗株親緣性較遠，與當前的流行株親緣關(guān)系密切。這些結(jié)果表明，WN株與CV777疫苗株相比，有明顯的遺傳變異傾向，可能導(dǎo)致目前PEDV疫苗免疫效果下降，PED疫情大規(guī)模流行。

豬流行性腹瀉病毒；基因克隆；序列分析；遺傳變異

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的豬的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉、體溫升高、嘔吐、脫水等[1-2]。本病多發(fā)于冬末春初和氣候多變的寒冷季節(jié)，初生哺乳仔豬最為易感，傳播快，治療不及時的致死率可達100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失[3]。疫苗免疫是防控 PED 疫情的重要手段，但2011年以來，可能由于大量PEDV變異株的存在導(dǎo)致疫苗免疫效果普遍下降，造成 PED疫情在國內(nèi)大規(guī)模流行[4-5]。

PEDV為有囊膜的單股線狀正鏈RNA病毒，屬冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)，基因組全長約 28 kb，至少存在 7 個開放閱讀框(ORF)，編碼 4 種結(jié)構(gòu)蛋白，纖突蛋白S(Spike, S)、小膜蛋白(Small membrane，E)、膜糖蛋白M(Membrane，M)和核衣殼蛋白N(Nucleocapsid，N)，以及 3 種非結(jié)構(gòu)蛋白(復(fù)制酶多聚蛋白Pol(1a/1b)和ORF3蛋白)[6]。M基因是 PEDV 的保守基因，編碼的 M蛋白結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，在病毒粒子的組裝和出芽過程中發(fā)揮重要作用，并可介導(dǎo)機體產(chǎn)生干擾素[7]。研究已證實， ORF3 基因編碼一種活化的鉀離子通道蛋白，參與病毒復(fù)制，能夠調(diào)節(jié)病毒量及病毒粒子的釋放，可能與 PEDV 的致病機理有關(guān)[8]。S蛋白是病毒粒子表面的囊膜蛋白，具有抗原性，是PEDV基因工程疫苗和診斷技術(shù)等研究中最重要的一個靶蛋白[9-10]。S 蛋白由1 383 個氨基酸組成，分為 S1區(qū)(1～789 位氨基酸)和 S2 區(qū)(790～1 383 位氨基酸)，S1區(qū)位于病毒表面，易產(chǎn)生突變，內(nèi)含主要的暴露性中和表位和受體結(jié)合域，內(nèi)分核心中和表位區(qū)(COE，499～638 aa)能夠刺激機體產(chǎn)生特異性的中和抗體，在病毒中和中發(fā)揮重要作用，S2區(qū)跨膜結(jié)構(gòu)位于病毒粒子內(nèi)部，多為隱蔽性表位，突變概率較小，幾乎不能刺激機體產(chǎn)生抗體，在病毒與宿主細胞融合中發(fā)揮重要作用，并決定病毒的組織嗜性和對細胞的侵染能力[11-12]。S基因作為病毒多樣性的標志，其突變可能導(dǎo)致病毒抗原性的改變，因此，關(guān)于S基因的研究對于判斷 PEDV的遺傳變異及疫苗免疫效果評價具有重要意義。

本研究通過對陜西渭南某規(guī)模化豬場腹瀉仔豬病料進行PEDVM基因的RT-PCR檢測，確認患豬感染PEDV，進一步對PEDV渭南分離株S基因部分序列、 ORF3基因、M基因進行序列和遺傳變異及抗原位點變化分析，為更好的監(jiān)測PEDV流行情況及PED疫情的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病 料

仔豬小腸及內(nèi)容物來自陜西渭南地區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)豬場20頭1～7日齡腹瀉死亡仔豬。無菌采集腹瀉仔豬的小腸及腸內(nèi)容物，放置冰盒中，在4 h 內(nèi)送至實驗室檢測。

1.2 主要材料

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ與TaqDNA聚合酶及PCR試劑購自TaKaRa(大連)公司；DNA Marker DL5000購自Transgen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自唯贊公司；快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)購自百泰克公司。

1.3 引物合成

參照GenBank公布的PEDV標準株CV777的全基因序列(GenBank登錄號：AF353511)，采用Primer 5.0軟件設(shè)計擴增PEDV ORF3、M、S基因部分序列的引物(表1)。

表1 引物及擴增產(chǎn)物信息Table 1 Information of primers and amplified products

1.4 病毒RNA的提取

取500 mg的小腸組織及其內(nèi)容物反復(fù)凍融3次，加入1 mL的生理鹽水于勻漿器中充分研磨，6 000 r/min離心15 min，取200 μL上清，按照Trizol Reagent說明書提取病毒RNA，提取的RNA -80 ℃保存，備用。

1.5 RT-PCR擴增

以提取的病毒基因組RNA為模板，按照試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。體系為：RNA模板2 μL，5×RT SuperMix 2 μL，RNase free ddH2O補至10 μL。反應(yīng)程序：25 ℃ 10 min，50 ℃ 35 min，85 ℃ 5 min。反應(yīng)完成后可立即進行PCR。PCR反應(yīng)體系為：PCR Mixture 10 μL；滅菌蒸餾水7 μL；引物PEDV-M-F 1 μL；PEDV-M-R 1 μL；cDNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物檢測為陽性的樣品進行 ORF3和 S1基因片段的RT-PCR擴增。

1.6 序列測定與分析

將M、 ORF3和S基因部分序列的PCR產(chǎn)物進行核酸凝膠電泳，將回收純化的目的DNA和載體pMD18-T連接，鑒定后進行序列測定。利用BLAST功能對所測得的M、 ORF3和S基因部分序列的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank已收錄的31株國內(nèi)外PEDV毒株的相應(yīng)序列進行比對分析，并使用MEGA 5.10構(gòu)建遺傳進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1病料PEDVM、ORF3和S基因部分序列RT-PCR

以RNA 為模板，利用引物PEDV-M-F和PEDV-M-R，對20份病料進行PEDVM基因的RT-PCR檢測，共檢測出9份陽性病料，檢出率為45%。電泳結(jié)果可見與預(yù)期大小750 bp一致的特異性條帶(圖1)。以RNA 為模板，利用引物PEDV-ORF3-F、PEDV-ORF3-R、PEDV-S1-F、PEDV-S2-R對陽性病料進行 ORF3和S基因部分序列的RT-PCR擴增(圖2，圖3)。

M.DNA marker DL5000；1～9.PEDV陽性病料PCR產(chǎn)物 PEDV gene PCR products;10.陰性對照 Negative control

圖1PEDV陽性病料RT-PCR擴增
Fig.1RT-PCRofPEDVpositivesamples

M.DNA marker DL5000 ;1.S基因PCR產(chǎn)物Sgene PCR product;2.陰性對照 Negative control

圖2S基因PCR擴增
Fig.2RT-PCRofSgene

M.DNA marker DL5000;1. ORF3基因PCR產(chǎn)物 ORF3 gene PCR products;2.陰性對照 Negative control

圖3ORF3基因擴增
Fig.3RT-PCRofORF3gene

2.2 PEDV分離株S基因部分序列分析

將檢測的陽性樣品命名為渭南(WN)株，與CV777疫苗株S基因序列比對，WN株存在多個突變位點，出現(xiàn)4個插入?yún)^(qū)域，164～166、177～179、181～186和416～418 nt，與中國近期分離毒株基因序列差異很小，而且在160～190 nt存在相同的變異情況(圖4)。氨基酸序列比對分析顯示，WN株S蛋白CEO區(qū)域存在9個氨基酸位點突變(圖5)。核苷酸同源性分析顯示，WN株與CV777疫苗株的同源性為91.2%，與中國近期流行株CH/KF/11和 BJ-2011-2的同源性較高，分別為99.3%和99.2%，與早期流行株CH/S同源性最低，為90.2%。氨基酸序列同源性分析顯示，WN株與CV777疫苗株同源性為89.4%，與近期流行株同源性為98.2%～98.9%，與中國早期分離株CH/S(1986年)、ZJCZ4(2004年)同源性較低，分別為88.9%和87.6%。

2.3PEDV分離株S基因部分序列遺傳進化樹分析

遺傳進化樹表明，G1分支主要集中包含WN株和中國2011-2012年近期分離毒株屬G1分支， CV777疫苗株、3株中國早期分離毒株和Attenuated DR13韓國弱毒疫苗株屬G2分支。分離株與CV777疫苗株及中國早期分離株親緣關(guān)系較遠，與2011-2012年的近期分離株親緣關(guān)系密切(圖6)。

WN.渭南株 WNstrain；CV777.CV777疫苗株 CV777 vaccine strain；其余為國內(nèi)外分離株 The others mean isolated strains home and abroad;下同 The same as below

圖4PEDVWN株和其他毒株S基因的主要缺失和插入位點
Fig.4ThedeletionandinsertioninSgeneofPEDVMNandotherstrains

2.4PEDV分離株ORF3基因序列及遺傳進化樹分析

與CV777疫苗株比對，分離株 ORF3基因存在11處突變位點(25:T→C；54：G→A；64：C→T 162:T→C；171: T→G； 237:C→T 369: T→C； 439: C→T；537: T→C；；579:T→G；627:C→T)。分離株與CV777疫苗株同源性相對較低，為98.2%，與2011年后中國分離毒株同源性為99%以上。

圖5 PEDV WN株和其他毒株S蛋白氨基酸序列的主要缺失和插入位點Fig.5 The deletion and insertion in S amino acids of PEDV WN and other strains

圖6 PEDV S基因核酸序列進化樹分析Fig.6 Phylogenetic analysis of full-length S gene of PEDV

遺傳進化樹表明，分離株與同處在G1分支的CV777疫苗株和23支中國毒株親緣關(guān)系較近，與處在G2分支的中國早期分離株毒株和韓國疫苗株Attenuated DRI3的親緣性較遠(圖7)。

2.5PEDV分離株M基因序列及遺傳進化樹分析

與CV777疫苗株序列比對發(fā)現(xiàn)WN株M基因存在8處堿基突變(37:G→C；127:T→C；180:A→G；222:C→T；285:T→C；348:T→A；603:A→G；618:T→C)，與CV777疫苗株的同源性98.2%，與同在GI分支的中國分離株GDYA、GDFS120 、GDST1 GDYE67、GDZQ120 HB/BD HB/GY、GDYED、JDYB、HB/LB及美國毒株MN同源性均為99%以上，與G2中的其他中國分離株的同源性為97.7%～98.5%。

WN株，2010-2012年中國近期分離毒株及2003-2007年韓國毒株處于GI分支， CV777及中國早期分離毒株處于G2分支。WN株與同在G1分支的2010-2012年中國近期分離株分離親緣關(guān)系較近，與CV777疫苗株及中國早期分離毒株關(guān)系較遠(圖8)。

▲.渭南株 WN strain； ■.中國分離株 Chinese isolated strains；其余為國外分離株 The others mean foreign isolated strains;下同 The same below

圖7PEDVORF3基因核酸序列進化樹分析
Fig.7Phylogeneticanalysisoffull-lengthORF3geneofPEDV

3 討 論

近年來的研究[13]顯示，目前仔豬病毒性腹瀉多是由PEDV引起的，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的危害。PED疫情在中國的出現(xiàn)，最早可追溯到20世紀70年代，1995年，哈爾濱獸藥研究所研制出豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎二聯(lián)苗，使PED疫情得到暫時有效的控制[14]。但2011年以來，PEDV在中國又呈現(xiàn)大規(guī)模流行趨勢，造成極大的經(jīng)濟損失，對于PED疫情的防控造成極大的挑戰(zhàn)[15]。通過對PEDV相關(guān)基因的序列及遺傳變異分析，可以為疾病的防控和疫苗的選用提供科學(xué)依據(jù)。

本研究中，PEDV WN株M基因序列與CV777疫苗株的同源性為98.2%，與中國近期中國分離株的同源性為97.7%～98.5%，與32株國內(nèi)外參考株同源性比較，同源性均在97%以上，說明PEDVM基因高度保守。 ORF3基因與CV777疫苗株同源性相對較低，為98.2%，與2010年后中國分離毒株同源性為99%以上，而且與國內(nèi)其它毒株存在相似的突變位點，是否這些突變影響PEDV復(fù)制及其毒力，導(dǎo)致PEDV目前的大規(guī)模流行還有待研究。S蛋白作為PEDV表面的囊膜蛋白，首先被機體免疫系統(tǒng)識別，隨后機體產(chǎn)生針對S蛋白中和表位的抗體[16]。S蛋白的COE區(qū)域有B細胞表位，參與B細胞識別及中和抗體產(chǎn)生，有研究[17-18]證實，針對COE區(qū)域的抗血清可以阻止宿主細胞被PEDV感染。S基因發(fā)生突變有可能導(dǎo)致COE區(qū)域抗原性的改變，從而導(dǎo)致S蛋白功能變化，造成疫苗保護力下降，致使PED疫苗免疫豬仍然爆發(fā)PED疫情的現(xiàn)象，所以進行S基因的序列分析對于研究PEDV的變異及評估疫苗免疫效果的有效性具有重要意義。本研究通過渭南株與CV777疫苗株及其他國內(nèi)外流行株的核苷酸和氨基酸序列差異比較，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)中國近期分離株同源性極高，并且與CV777疫苗株相比發(fā)生明顯且相似的變異，表明中國目前PEDV流行株與CV777疫苗株相比，有明顯且穩(wěn)定的遺傳變異現(xiàn)象，推測目前中國的PEDV流行株可能來源于相同的毒株，并且具有強毒力，引起目前 PED疫情的大規(guī)模流行和疫苗免疫效果的普遍下降。所以有必要進行更多關(guān)于PEDV毒株基因變異與現(xiàn)有疫苗保護力的探究，為PEDV的遺傳變異情況以及新疫苗的選擇提供更多的科學(xué)依據(jù)。

圖8 PEDV M基因核酸序列進化樹分析Fig.8 Phylogenetic analysis of full-length M gene of PEDV

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GeneticVariationAnalysisofPorcineEpidemicDiarrheaVirusofWNStraininShaanxiProvince

WU Mengmeng, XU Xiapeng, ZHANG Yanming, ZHOU Hongchao and GUO Kangkang
(College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

Suspected piglet samples of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection were collected from one large-scale swine farms in Weinan, Shaanxi province, and then the possible reason for the occurence of PED in vaccine immune swine farm was detected by genetic variation analysis. It showed that nine positive PEDV samples were detected in 20 intestinal contents samples from suspected piglet by the method of RT-PCR. And then the sequence of theMgene, ORF3 gene, and partialSgene of PEDV were amplified from the positive samples. Sequence analysis shows that M gene of PEDV in WN strain is relatively conserved, sharing 98.2% nucleotide sequence homology with the CV777 strain;11 nt mutations were detected in the ORF3 gene, which sharing 98.2% nucleotide sequence homology with the CV777 strain; the S gene in WN strain is variable with 4 insertions regions, including 164-166 nt,177-179 nt,81-186 nt and 416-418 nt, and 9 aa mutations in COE(499-638 aa) region, which contains the epitope regions inducing the production of neutralizing antibodies for PEDV. Genetic analysis shows that theMgene in WN strain keeps a closer relationship with the isolated strains in China recently than other isolated strains; the ORF3 gene keeps a closer relationship with the isolated strains of China in G1 than the CV777 strain in G2; theSgene has a closer relationship with the epidemic isolated strains recently than the CV777 strain and the isolated strains in China early times. It shows that obvious genetic variation has been occurred in WN strain of PEDV, which may be responsible for the poor immunity protection of vaccines for PEDV and the large-scale spread of PED in swine farms currently.

PEDV(Porcine epidemic diarrhea virus); Gene cloning; Sequence analysis; Genetic variation

2016-06-12

2016-08-06

Agriculture Science and Technology Promotion and Demonstration Project in Shannxi Province (No.ZDKJ2014-33)；Shannxi Science and Technology Innovation Project Plan(No.2014KTCQ02-02).

WU Mengmeng, female,master student. Research area:pathogenic mechainsm of virus disease. E-mail:656820485@qq.com

S852.65+9.6

A

1004-1389(2017)09-1273-08

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsibleeditor:GUYulan)

日期：2017-09-12

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170912.1740.004.html

2016-06-12

2016-08-06

陜西省重點農(nóng)業(yè)科技推廣及示范項目(ZDKJ2014-33)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃(2014KTCQ02-02)。

吳萌萌，女，碩士研究生，研究方向為動物病毒病致病機理。E-mail:656820485@qq.com

張彥明，男，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向為動物病原學(xué)和獸醫(yī)公共衛(wèi)生。E-mail:zhangym@nwsuaf.edu.cn 郭抗抗，男，碩士生導(dǎo)師，副教授，研究方向為動物病原學(xué)和獸醫(yī)公共衛(wèi)生。E-mail:Guokk2007@nwsuaf.edu.cn

CorrespondingauthorZHANG Yanming ,male, doctoral supervisor,professor.Research area:animal etiology and veterinary public health. E-mail:zhangym@nwsuaf.edu.cn

GUO Kangkang , male, master supervisor,asociate professor.Research area:animal etiology and veterinary public health. E-mail:Guokk2007@nwsuaf.edu.cn