高效液相色譜法測定金銀花連翹提取物中綠原酸、咖啡酸的含量

劉愛華

哈藥集團三精制藥有限公司 150000

高效液相色譜法測定金銀花連翹提取物中綠原酸、咖啡酸的含量

劉愛華

哈藥集團三精制藥有限公司 150000

金銀花是通過一種常見的中藥藥材，藥性甘、寒，因為具有清熱解毒的療效，臨床醫學中常被用以治療風寒感冒、熱毒血痢等疾病。高效液相色譜法由于其獨有的先進性和科學性，常被化學、醫學、工業等領域用來進行成分分離和檢定工作。本文將對采用高效液相色譜法測定金銀花連翹提取物中綠原酸、咖啡酸的含量的實驗進行簡要介紹和分析，希望能為廣大醫療工作者的工作提供幾點值得參考的意見。

高效液相色譜法；金銀花；連翹；提取物；綠原酸；咖啡酸；含量

金銀花作為一種常見的中藥藥材，在臨床醫學實驗中得到了廣泛的應用。而金銀花的連翹部位，由于其含有綠原酸和咖啡酸等物質，在醫學實驗中，也有其特殊用途。本文將對才有高效液相色譜法測定金銀花連翹提取物中綠原酸、咖啡酸的含量的實驗進行簡要分析，希望可以得出有用的結論。

金銀花也被成為忍冬，由于其開花時獨特的顏色變化而得名金銀花。金銀花在臨床醫學中的應用非常廣泛，由于其能夠清熱解毒、抗炎、凝血等作用，常被用于治療外寒感冒、溫病發熱等疾病。與此同時，金銀花也可以與其他藥材搭配，緩解人體口干、煩悶等不良癥狀，也可以用于呼吸道類疾病的治療。金銀花這味藥材有多種入藥形式，其中提取物的形式在目前的制藥過程中被最為廣泛的使用。通常情況下，金銀花提取物可以直接以煎煮的形式，通過半成品的形式被使用。另一方面，也可以通過一定的手段對金銀花的含有藥效的部位進行提取之后，再入藥使用。為了保證藥品中金銀花提取物的含量，通過科學的方法及相關實驗準確的測量其有效部位提取物中的綠原酸和咖啡酸的含量非常有必要。

1.驗儀器與藥品的選擇

合理的選擇實驗所用的儀器和藥品樣品，將能夠對準確測得實驗數據起到一定的保障作用，因此，選擇過程必須嚴格遵循相關規定。

Agilent 1100 series高效液相色譜儀(G 1322A排氣閥,G 1311A泵,G 1316A柱溫箱,G 1314A紫外檢測器),chemistation色譜工作站,KromasilC18色譜柱,超聲提取器(KQ 3200DE型數控超聲儀昆山市超聲儀器有限公司);綠原酸對照品(中國藥品生物制品鑒定所,批號110753- 200212),金銀花提取物(本實驗室自制),乙腈,磷酸均為分析純;水為雙蒸水。

2 實驗的方法、過程與結果

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法的合理應用能夠比較科學、準確地測出實驗所需數據，因此，本實驗選擇應用高效液相色譜法。實驗過程中，必須滿足該方法的應用要求。

液相色譜和質譜連接，可以增加額外的分析能力，能夠準確鑒定和定量像細胞和組織裂解液，血液，血漿，尿液和口腔液等復雜樣品基質中的微量化合物。高效液相色譜質譜系統（ABSciex Eksigent LC / MS和LC / MS / MS）提供了一些獨特的優勢，包括：

(1)快速分析和流轉所需的最少樣品準備

(2)高靈敏度并結合可分析多個化合物能力，甚至可以跨越化合物的種類

(3)高精確度，高分辨率鑒定和量化目標分析物

高效液相色譜法有“四高一廣”的特點：

①高壓：流動相為液體，流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。

②高速：分析速度快、載液流速快，較經典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在 15～30分鐘，有些樣品甚至在 5分鐘內即可完成，一般小于1小時。

③高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

④高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在μL數量級。

⑤應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物的分離分析，顯示出優勢。

⑥柱子可反復使用：用一根柱子可分離不同化合物

⑦樣品量少、容易回收：樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

此外高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。高效液相色譜的缺點是有“柱外效應”。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

2.1.1 色譜

高效液相色譜法的應用，對色譜有著比較高的要求。本實驗選用了我國制造生產的KromasilC18液相色譜柱。實驗過程中，控制了色譜柱溫度保持在25攝氏度，選用12單位的乙腈和88單位的0.4%的磷酸作為實驗的流動相。與此同時，實驗過程中，流速控制在1ml/min的狀態下，實驗使用的檢測波長為327nm。

2.1.2 實驗環境

由于實驗的環境 ph值，將對實驗結果產生影響。因此必須對其進行嚴格的控制。由于綠原酸是有機酸的化學特性。在進行高效液相色譜法進行實驗時，為避免出現前沿或拖尾峰的現象，需要在實驗的流動相中加入某種酸性物質。本實驗對流動相中加入乙酸和磷酸的情況進行了對比，可知選用 0.4%的磷酸，能夠得到所需的色譜峰形。

2.1.3 色譜系統適應性實驗

在選定條件下,綠原酸和樣品中其他組分可基線分離,綠原酸與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5,理論塔板數(N)為5 000以上。結果見圖1。

圖1 金銀花提取物高效液相色譜法圖譜

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品適量,置棕色量瓶中,加 50%甲醇制成每毫升含35.8μg的溶液,即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取本提取物10mg,置100ml容量瓶中,雙蒸水溶解,超聲2min后,再用雙蒸水定容至刻度,搖勻,過0.45μg微孔濾膜,取續濾液即得。

2.4 線性范圍的考察及其標準曲線的繪制

精密吸取對照品溶液 2, 4,6,10,14,18μl,分別注入液相色譜儀。按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積積分值(A)對進樣量進行回歸,得回歸曲線方程:Y=2468.4X-16.205,r= 0.9996。結果表明,綠原酸在0.071 6～ 0.644 4μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。結果見圖2。

圖2 綠原酸標準曲線

2.5 精密度實驗精密吸取對照品溶液10μl,按上述色譜條件重復進樣6次,記錄各組綠原酸峰面積值,結果平均峰面積為:840.5,RSD為0.69%(n=6)。

2.6 穩定性實驗

取同一供試品溶液,分別于0,2,4,6,8h進樣10μl,測得綠原酸的平均峰面積值為:680.24,RSD為:0.38%(n= 5),表明供試品溶液在8h內穩定。

2.7 重復性實驗

取同一批號(070204)樣品 6份,按含量測定方法測定,結果綠原酸平均含量為28.01%,RSD為1.07%(n=6)。

2.8 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的金銀花提取物6份,分別精密添加綠原酸對照品適量,按供試品溶液的方法制備,測定,計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收率實驗結果

2.9 樣品測定

取 3批樣品,按照上述方法制備供試品溶液,進樣 10μl,依照已確定的色譜條件測定,按峰面積值用外標法計算樣品中綠原酸的含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（%）

3 討論

金銀花提取物以有機酸為有效成分,本實驗以綠原酸含量作為金銀花提取物的質量控制指標,同時測定了 3批金銀花提取物中綠原酸的含量,通過計算,其含量均在 20%以上。本文所建立的方法簡便、快捷,重復性及穩定性均較好,可在實際生產中用于該提取物的質量控制。本文所做的工作為開發金銀花的相關產品提供了質量監控方法。

金銀花是一種常見且應用廣泛的中藥藥材，對其合理的運用能夠以相對低廉的價格進行多種疾病的治療。而連翹作為金銀花的主要藥效部位，對其合理的運用，能夠使其中的綠原酸和咖啡酸發揮出應有的效果。在臨床醫學中，醫學工作者應加強對金銀花的了解，使這種藥材發揮出它能起到的最大的藥理作用。

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A< class="emphasis_bold">[文章編號]1

1672-5018（2017）03-035-02