慶大霉素發酵培養基優化的研究

嚴寶冬

黑龍江格林赫思生物科技有限公司 大慶 166400

慶大霉素發酵培養基優化的研究

嚴寶冬

黑龍江格林赫思生物科技有限公司 大慶 166400

目的：對慶大霉素發酵的培養基配方進行優化，通過對幾種主要原輔料玉米淀粉、玉米粉、黃豆餅粉、蛋白胨、輕質碳酸鈣的用量進行調整，最后確定的培養基組合大大提高了發酵生產水平，而且降低了生產成本。

慶大霉素；培養基；發酵；優化

慶大霉素是一類由微生物或其他生命過程中合成的次級代謝產物或其人工衍生物，它們在很低濃度時就能抑制或干擾它種生物（包括病原菌，病毒，癌細胞等）的生命活動，因而可用作優良的化學治療劑，也是臨床上廣泛使用的處方藥。慶大霉素屬于氨基糖苷類抗生素，主要是由絳紅小單孢菌（Micromonospora purpurea）、棘孢小單孢菌（M.echinospora）發酵產生的一種殺菌力較強的多組分氨基糖胺類廣譜抗生素。1963年由美國先令公司Weinstein等發現，1969男被用于臨床，國外稱之艮他霉素或正泰霉素。慶大霉素同時也是我國獨立自主研制成功的廣譜抗生素。1966年，我國著名的微生物學家王岳和助手從小單孢菌中分離到全國聞名的慶大霉素產生菌，并且在 1967年開始研制，到1969年底獲得成功。之所以取名“慶大霉素”，是為了慶祝“九大”以及工人階級的偉大勝利。目前，慶大霉素仍然是臨床上和畜牧業治療各種革蘭氏陰性菌感染的主要抗生素之一。因此，慶大霉素的相關研究仍然具有重要意義。

我國慶大霉素的生產歷史已經有四十余年，國內生產慶大霉素的生產廠家主要為福抗、煙臺只楚藥業、南陽普康集團、上海先鋒，總體來說生產水平不高，生產工藝改進也不大，生產菌種大多選擇絳紅小單孢菌，一般采用深層液態發酵法，國內生產水平一般維持在1200-1400U/ml左右，產量較低。國外生產菌株多使用棘孢小單孢菌或橄欖星小單孢菌，發酵周期較長、成本較高，這也使得生產受到一定的限制。

目前對于慶大霉素提高單位效價的措施主要是優良菌種的篩選和工藝的優化兩種方式。大多數工廠對慶大霉素提高發酵單位的措施主要是工藝優化。雖然國內外眾多科研工作者曾經致力于采用傳統的誘變育種手段來改造小單孢菌的生物合成，但是往往收效甚微。

慶大霉素生產的培養基主要為玉米淀粉、玉米粉、黃豆餅粉、蛋白胨、輕質碳酸鈣，本文主要針對這幾種培養基的最佳用量進行正交化組合，得到最佳的培養基用量組合，從而提高慶大霉素的發酵生產水平。

1.資料和方法

1.1 菌種：絳紅小單孢菌（黑龍江格林赫思生物科技有限公司生產用菌種）。

1.2 培養基

玉米淀粉、玉米粉、黃豆餅粉、蛋白胨、輕質碳酸鈣、硫酸銨、硝酸鉀等。

1.3 設備

1.3.1 實驗室設備：搖瓶機，500ml三角瓶

1.3.2 發酵罐：1500L發酵罐

1.4 培養方法

1.4.1 搖瓶發酵

將子瓶斜面菌種在無菌室內挑取2cm2接種于滅菌后的搖瓶培養基中，每瓶500ml三角瓶裝量50ml培養基，37±1℃、360r/min培養135小時，放瓶取樣，檢測慶大霉素生物效價及其組分比例。

1.4.2 1500L發酵罐發酵

將5瓶子瓶斜面菌種在無菌室用無菌水洗下，制成孢子懸浮液，將孢子懸浮液接入1500L發酵罐，罐壓0.05Mpa，通氣量1:1，攪拌速度120r/min，，發酵培養135小時 ，放罐，測定慶大霉素生物效價及其組分比例。

1.5 效價測定

采用抗生素微生物檢定法。

2 結果與討論

2.1 搖瓶發酵結果

2.1.1 正交法設計實驗

發酵試驗的影響因素很多，培養基中主要是碳源氮源，為菌體生長提供了大部分能量，所以選擇培養基中5個主要因素進行研究：玉米淀粉、玉米粉、黃豆餅粉、蛋白胨、輕質碳酸鈣，根據單因子實驗結果確定各因素的最佳含量范圍，采取五因素三水平正交試驗模式，因素水平表見表1。

表1 正交試驗水平表

按照四水平五因素的實驗安排，共做 16組實驗，每一組實驗平行5瓶，所得結果為5瓶的平均結果，實驗結果見表2。

表2 L9（35）正交試驗結果

從表2中極差可以看出，以上5個因素對慶大霉素產量影響的順序為：玉米淀粉＞蛋白胨＞黃豆餅粉＞玉米粉＞輕質碳酸鈣，實驗組中最佳結果是第八組，（A2B4C3D2E1），從分析數據中得出，最優培養基配方為A2B4C3D2E1，通過驗證試驗得出，這個配方的慶大霉素效價最終保持在1450u/ml左右，產量穩定。根據原始配方，平行做出現用的培養基發酵試驗，最終效價穩定在1200u/ml左右，新的最優配方效價提高了16.7%。

所以確定最終培養基配方為玉米淀粉5.5g/L，玉米粉1.6g/L，黃豆餅粉4.0g/L，蛋白胨0.65g/L，輕質碳酸鈣0.6g/L。

2.2 1500L噸發酵罐驗證結果

將優化的培養基配方在1.5噸發酵罐上進行驗證，連續上罐7次，其結果見表3

從表3可以看出，慶大霉素的發酵過程中，應用新的最優培養基配方，連續實驗效果很穩定，并且經過成本核算，生產成本較原有的培養基配方成本低，增加了生產利潤，降低了單位能耗。

3 結語

本實驗所采用的優化培養基發酵所得結果，各組分比例滿足新藥典要求，并且雜志顯著降低，為下游的色譜分離工作帶來很大便利。

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