不同因素對(duì)南方紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)的初步研究

王榮明，陳秋良，王 燁，吳紅梅，劉人菁

（1.屏邊縣農(nóng)廣校，云南 紅河 661200；2.屏邊縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)站，云南 紅河 661200；3.紅河州農(nóng)廣校，云南 紅河 661200）

不同因素對(duì)南方紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)的初步研究

王榮明1，陳秋良3，王 燁1，吳紅梅2，劉人菁2

（1.屏邊縣農(nóng)廣校，云南 紅河 661200；2.屏邊縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)站，云南 紅河 661200；3.紅河州農(nóng)廣校，云南 紅河 661200）

本試驗(yàn)主要研究不同因素對(duì)南方紅豆杉(Taxus chinensis var mairei)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，通過(guò)不同的材料（幼嫩莖段、葉柄、葉、芽）、不同培養(yǎng)基、不同光照條件以及不同的激素配比4個(gè)方面來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)誘導(dǎo)南方紅豆杉愈傷組織，旨在篩選出適合誘導(dǎo)南方紅豆杉愈傷組織的最佳配方、適宜的培養(yǎng)條件和適宜的外植體。

南方紅豆杉；組織培養(yǎng)；外植體；愈傷組織；誘導(dǎo)

1 前言

紅豆杉屬(Taxus Linn.)植物在全世界大約有11種，我國(guó)有4種1變種[1]。從紅豆杉屬植物中分離出來(lái)的一種抗腫瘤特效成分——紫杉醇,具有抗白血病、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌等癌癥的效用[2]，因?yàn)樗且环N新型、高效、廣譜抗癌藥物，且制劑市場(chǎng)前景極好，所以紫杉醇成為當(dāng)今最熱門(mén)的抗癌藥物之一。近年來(lái),眾多學(xué)者在南方紅豆杉組培微繁育苗方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究,并在組培微繁關(guān)鍵技術(shù)，如光照、溫度、pH調(diào)控以及外植體選用和激素配比等方面都取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展[3]。

本文通過(guò)不同外植體、不同培養(yǎng)基、不同光照條件和不同激素配比4個(gè)方面對(duì)南方紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)進(jìn)行研究，旨在篩選出最適合誘導(dǎo)南方紅豆杉愈傷組織的最佳配方、適宜的培養(yǎng)條件和適宜的外植體，從而能大量地誘導(dǎo)出愈傷組織，試圖為進(jìn)一步大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)、生產(chǎn)紫杉醇奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料的選擇

外植體采自屏邊苗族自治縣玉屏鎮(zhèn)引種的南方紅豆杉5年生枝條，選擇當(dāng)年生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的幼嫩莖段、葉柄、葉、芽作外植體。

2.2 材料的處理

把取來(lái)的材料流水沖洗后，置于70%乙醇中浸泡數(shù)秒,再用0.2%HgCl2滅菌數(shù)分鐘，無(wú)菌水沖洗3～5次,置于無(wú)菌濾紙上吸去材料表面水分,切取2～3 cm的材料供接種用。

2.3 不同材料對(duì)愈傷組織的影響因素

以MS為基本培養(yǎng)基，以下所有培養(yǎng)基均含蔗糖2.5%、瓊脂0.7%,pH值5.8，培養(yǎng)溫度為25℃左右，暗培養(yǎng)，每天進(jìn)行觀(guān)察，試驗(yàn)配方為：MS+6-BA 0.5 mg· L-1+NAA 1.0 mg·L-1。取南方紅豆杉不同外植體材料進(jìn)行試驗(yàn)，觀(guān)察不同外植體（即葉片、芽、葉柄、幼嫩莖段）誘導(dǎo)愈傷組織的情況，篩選出誘導(dǎo)率最佳的外植體。

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的影響因素

設(shè)計(jì)4種不同的培養(yǎng)基：MS、B5、改良懷特培養(yǎng)基White、TA（大量元素：KNO325 00 mg/L、NH4NO3825 mg/L、KH2PO4240 mg/L、MgSO4·7H2O 370 mg/L、CaCl2·2H2O 600 mg/L，其余成分同MS），通過(guò)試驗(yàn)篩選出最適合紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

2.5 不同的光照條件對(duì)愈傷組織的影響

以TA+6-BA0.5 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1為基本培養(yǎng)基，然后通過(guò)黑暗培養(yǎng)與光照培養(yǎng)進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，通過(guò)試驗(yàn)說(shuō)明紅豆杉的愈傷組織是適合黑暗培養(yǎng)還是適合光照培養(yǎng)，或者是適合先黑暗培養(yǎng)幾天后轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)。

2.6 不同激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

設(shè)計(jì)4組不同的激素梯度（TA+1.0 NAA+0.5 6-BA、TA+0.5 NAA+0.05 6-BA、TA+3 NAA+2.8 6-BA+1.2 2,4-D、TA+1.0 2,4-D+0.5 6-BA），按照以上的最佳培養(yǎng)條件，篩選出最適合誘導(dǎo)紅豆杉愈傷組織的最佳激素配比。

3 討論

根據(jù)本試驗(yàn)的研究經(jīng)過(guò)，外植體污染依次為：嫩莖段＜芽＜葉柄＜葉片；而誘導(dǎo)率依次為：芽＜葉片＜葉柄＜幼嫩莖段。綜合上述情況,以新生幼嫩嫩莖作為外植體是較好的選擇（表1）。

合適的培養(yǎng)基對(duì)南方紅豆杉組織培養(yǎng)至關(guān)重要。本試驗(yàn)通過(guò)四種不同的培養(yǎng)基（MS、B5、White、TA）進(jìn)行試驗(yàn)，得出TA培養(yǎng)基愈傷組織的誘導(dǎo)率高達(dá)96%，并且增長(zhǎng)量最多，誘導(dǎo)率依次為：TA＞MS＞W(wǎng)hite＞B5（表2）。

有報(bào)道稱(chēng)光照條件不利于愈傷組織誘導(dǎo)，因?yàn)楣庹諚l件會(huì)激活紅豆杉愈傷組織內(nèi)的多酚氧化酶，從而促進(jìn)愈傷組織褐化。暗培養(yǎng)可在一定程度上減輕褐變程度，同時(shí)培養(yǎng)溫度不宜過(guò)高。溫度過(guò)高可能提高PPO活性,加速褐化。本實(shí)驗(yàn)研究表明：黑暗條件下誘導(dǎo)紅豆杉愈傷組織出愈時(shí)間最早且誘導(dǎo)率最高，依次為：黑暗培養(yǎng)，光照培養(yǎng)，先暗培養(yǎng)、再光照（表3）。

表1 不同材料對(duì)愈傷組織的影響因素

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的影響因素

表3 不同光照條件對(duì)愈傷組織的影響因素

南方紅豆杉組織培養(yǎng)中,常用生長(zhǎng)素有2,4-D (2,4-二氯苯氧基乙酸)、NAA(萘乙酸),常用細(xì)胞分裂素有6-BA(6-芐氨基嘌呤)、KT(激動(dòng)素)。通常將生長(zhǎng)素和分裂素配合使用,并根據(jù)培養(yǎng)階段和外植體情況進(jìn)行濃度配比。根據(jù)表4可得出適合誘導(dǎo)紅豆杉愈傷組織的最佳激素配比依次為：2＞1＞3＞4。試驗(yàn)結(jié)果表明愈傷組織在這兩種組合（0.3 NAA+0.05 6-BA）條件下生長(zhǎng)旺盛，相對(duì)生長(zhǎng)量大，愈傷化程度高。

表4 不同激素對(duì)愈傷組織的影響因素

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同的外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)后，得出紅豆杉的幼嫩莖段是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳材料；通過(guò)不同的培養(yǎng)基試驗(yàn)后得出TA為誘導(dǎo)紅豆杉愈傷組織的最佳培養(yǎng)基，這與前人的試驗(yàn)想吻合；通過(guò)在不同的光照條件下得出黑暗培養(yǎng)最適合誘導(dǎo)紅豆杉愈傷組織；通過(guò)4種不同的激素配比后得出，誘導(dǎo)紅豆杉的最佳激素配比為：0.3NAA+0.05 6-BA。

綜上所述，誘導(dǎo)紅豆杉愈傷組織應(yīng)該選取幼嫩莖段為試驗(yàn)材料，在黑暗的環(huán)境下，TA+0.3 NAA+0.05 6-BA進(jìn)行培養(yǎng)，可以獲得大量的愈傷組織，試圖為進(jìn)一步大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇奠定基礎(chǔ)。

[1]李湘萍,朱政德.紅豆杉屬植物的地理分布與應(yīng)用前景[J].1994 (4):20-21..

[2]閻家麒,范金稱(chēng),王九一.紫杉醇提取分離純化工藝[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,1996,27(12):531-534.

[3]何康,樊正球,李麗,等.南方紅豆杉組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007, 15(5):215-218.

2017-08-15）

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1005-2690（2017）09-0137-02

S791.49

B

王榮明(1987-)，男，彝族，中級(jí)農(nóng)藝師，主要從事組培育苗和農(nóng)民科技教育工作；王燁(1974-)，女，漢族，中級(jí)農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)民科技教育工作；吳紅梅(1973-)，女，漢族，中級(jí)農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)業(yè)技術(shù)的推廣應(yīng)用工作；劉人菁(1990-)，女，漢族，中級(jí)農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)業(yè)技術(shù)的推廣應(yīng)用工作；陳秋良(1982-)男，彝族，農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)民科技教育工作。