β-興奮劑在動物性食品中殘留的免疫分析方法研究進展

劉碩，陶曉奇

(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)

β-興奮劑在動物性食品中殘留的免疫分析方法研究進展

劉碩，陶曉奇*

(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)

β-興奮劑能夠降低動物體內脂肪含量，促進蛋白質合成，提高瘦肉率和飼料轉化率，常被用作飼料添加劑。但是由于β-興奮劑會在動物組織內殘留，通過動物源食品進入人體內，會引起心悸、頭疼、毒害肝腎等嚴重危害，包括我國在內的大多數國家已禁止畜牧業中應用此類藥物。文章就免疫分析法總結介紹其基本原理、研究進展、優缺點、發展趨勢，涵蓋放射免疫分析、酶免疫分析、化學發光免疫分析、熒光免疫分析、膠體金標記免疫分析、免疫傳感器、免疫芯片、流動注射免疫分析、免疫PCR等技術。

β-興奮劑；免疫分析法；快速檢測

β-興奮劑，又稱為β-腎上腺素受體興奮劑，是一組結構和生理功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物，用于哮喘和產后疼痛的臨床治療[1]，同時能夠通過刺激β-腎上腺素受體促進蛋白質合成，增加肌肉生長和減少脂肪沉積[2]。根據苯環上取代基的不同分為苯胺型、苯酚型以及苯二酚型三大類，常見有克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、溴布特羅等。

然而，若動物攝入β-興奮劑且殘留于動物體內的藥物通過食物鏈進入人體中，輕則引起心悸、頭疼、目眩、惡心，重則對肝、腎等內臟器官產生毒副作用[3]。目前，歐盟已禁止在畜牧業中使用此類藥物[4]，我國農業部235號文件規定：克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅及其鹽、酯在所有食品動物及所有可食組織中禁止使用，并且不得檢出[5]。

免疫分析法(immunoassays，IAS)是以抗原抗體特異性結合為基礎的分析方法。本文主要對各種免疫分析法在β-興奮劑類獸藥殘留檢測中的應用進展進行綜述。

1 放射免疫分析

放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)是利用同位素標記的與未標記的抗原(抗體)同抗體(抗原)發生競爭性抑制反應的放射性同位素體外微量分析方法，最早由美國科學家YALOW和BERSON[6]利用131I標記的胰島素與血漿中的胰島素競爭有限的抗體。GRANJA等[7]對于β-興奮劑(克倫特羅，馬布特羅，溴布特羅，西馬特羅，辛可特羅)的多殘留篩選方法和在牛肝臟中沙丁胺醇的多殘基篩選方法進行了驗證研究，8種目標化合物的檢測能力值為0.25～0.5 g/kg。該法靈敏度達10-12～10-13mol/L、特異性強、精確度佳且樣品用量少，但放射性核素對人體存在一定的危害，限制其在農獸藥殘留分析中的應用，甚至趨向于被淘汰。

2 熒光免疫分析

熒光免疫分析(fluorescent immunoassay，FIA)是以熒光物質標記抗原或抗體作為示蹤物的一種免疫測定方法，分為熒光偏振免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、量子點熒光免疫分析、熒光猝滅免疫分析和熒光增強免疫分析等幾類：

1.1熒光偏振免疫分析(fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA)

熒光偏振免疫分析采用均相反應模式，是一種基于熒光偏振和免疫競爭原理的定量免疫分析技術，游離的藥物分子體積小，受到偏振光照射后產生熒光的偏振方向被分散，而小分子藥物與抗體結合后，增大了分子體積，受到偏振光照射后能產生偏振光，且隨著濃度的增大而增大[8]。袁利鵬等[9]將沙丁胺醇半琥珀酸與異硫氫酸熒光素己二胺衍生物反應合成熒光示蹤物SAL-HDF，利用熒光偏振免疫分析法檢測沙丁胺醇，通過優化示蹤物和抗體的最適工作質量濃度，結果表明，該法的LOD值為72.36 ng/mL，IC50為975.18 ng/mL，檢測范圍為178.08～4 871.15 ng/mL，平均回收率為(99.91±2.60)%，變異系數為2.60%。FPIA的優點為在實驗過程中不需要分離，反應僅需要幾秒鐘到幾分鐘。同時，FP是一個比值，不會受到溶液顏色轉變及儀器靈敏度的影響。因此，FPIA的檢測結果穩定、重現性好，近年來在獸藥殘留檢測中的應用日趨廣泛，但這種方法，靈敏度比ELISA低，檢測限一般在0.1～10 ng之間，檢測過程中容易受到光散射和樣本基質的影響[10]。

1.2時間分辨熒光免疫分析(time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)

該法為消除生物材料中的背景干擾，根據背景具有熒光衰變期短的特點，利用長壽命的熒光物質進行標記，當壽命較短的生物材料背景熒光完全衰減后再進行檢測以此消除本底的干擾，采用鑭系元素作標記物，可保存1～2年，靈敏度達到RIA水平。侯文慧[11]用銪標記時間分辨熒光免疫法檢測沙丁胺醇，IC50為1.6 ng/mL，檢測范圍為0.39 ng/mL～12.77 ng/mL，LOD值為0.136 ng/mL，其特異選擇性高，與克倫特羅的交叉率較小(2.29%)，而與萊克多巴胺沒有交叉，在豬肉、豬肝、豬尿、飼料4 種基質的平均加標回收率分別為98.02%、96.03%、108.73%、 106.09%。

1.3熒光猝滅免疫分析(fluorescencequenchingimmunoassay，FQIA)和熒光增強免疫分析(fluorescenceenhancedimmunoassay，FEIA)

熒光淬滅免疫分析法的原理是當熒光標記物與抗體結合發生熒光淬滅，熒光增強免疫分析法的原理是熒光標記物與抗體結合后熒光強度增強。史聰穎等[12]建立高靈敏度的熒光猝滅試紙條技術用于檢測豬尿、豬肉中萊克多巴胺，靈敏度為0.16 ng/mL，檢測范圍為0.16～20 ng/mL。該方法回收率為97.2%～106.1%，最大相對標準偏差為3.84%(批內)；對于批間重現性實驗，回收率為89.0%～109.1%，最大相對標準偏差為6.34%。ZHANG等[13]采用以膠體金為基礎的熒光猝滅免疫層析分析法測定樣品中的β-興奮劑，當抗體量為0.8 μg/mL，檢測時間為15 min時，免疫層析測試條的LOD值為0.12 ng/mL，可同時測定五種β-興奮劑，當通過該法測試加標的豬尿液樣品(5.0 ng/mL和10.0 ng/mL)時，回收率分別為(39.00±3.0)%和(32.00±2.0)%。

1.4量子點熒光免疫分析

量子點熒光強度比傳統有機熒光強度高100倍，具有狹窄的熒光發射光譜和較大的Stokes位移。以量子點作為熒光標記的探針開發的熒光免疫分析方法，能夠大幅度的提高農獸藥殘留的檢測靈敏度[14]。WANG等[15]用量子點熒光免疫分析法對樣品中的萊克多巴胺進行測定，結果表明，熒光免疫法LOD值為1 ng/mL，分析時間為4 h，適合痕量檢測。ZHOU等[16]制備超穩定水溶性CdSe / ZnS量子點(QDs)作為熒光標簽，用競爭性側流免疫(LFIA)生物傳感器系統檢測萊克多巴胺在豬尿液中的殘留，其可靠檢測限被成功地減至0.1 ng/mL，這比商業RAC側流免疫分析帶高了30多倍。

傳統熒光物質干擾性大、靈敏度低。熒光偏振免疫測定法、時間分辨熒光免疫法及量子點熒光免疫法等的出現使得FIA的靈敏度得到了大幅度提升。FIA可進行全自動大批量檢測，相信其在獸藥殘留檢測中具有良好的應用前景[17]。

3 酶免疫分析

酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA)是20世紀70年代后迅速發展起來的非同位素免疫測定法，其原理是在抗體或抗原分子上標記特定的酶，根據抗原和抗體反應的特異性以及具有高效性的酶催化顯色反應對一些超微量殘留物進行檢測[10]。根據其反應介質和步驟的不同分為非均相酶免疫分析和均相酶免疫分析2大類，后者大多用于治療藥物的檢測，此處不作詳細介紹：

非均相酶免疫分析即抗原、抗體反應在固液相間進行，反應平衡后進行兩相分離，其典型代表是Engvall和Perlman創立的酶聯免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[18]，用于獸藥殘留分析，分為抗體包被直接競爭ELISA、抗原包被直接競爭ELISA和間接競爭ELISA三種模式，此處主要介紹后2種：

3.1抗原包被直接競爭ELISA(directcompetitiveELISAwithantigenscoatedonthesolidphase)

將抗原包被到聚苯乙烯96孔板上，加入待測物和酶標記抗體競爭結合包被抗原，平衡后洗滌，加底物顯色并檢測。DU等[19]用抗原包被直接競爭ELISA法對組織和飼料樣品中的殘留溴布特羅進行測定，其IC50和LOD值分別為0.165 ng/mL和0.007 ng/mL，與克倫特羅，特布他林和西布特羅的交叉反應性小于6.2%，與9種其他化合物沒有交叉反應性，對肝、肉和飼料樣品加入不同濃度的溴布特羅并通過ELISA分析，其回收率為91.9%～115.4%，分析內變異系數為1.5%～9.5%(n= 3)。

3.2間接競爭ELISA(indirectcompetitiveELISA)

間接競爭 ELISA與抗原包被直接競爭 ELISA競爭方式的相同，一抗與抗原結合后與二抗結合，顯色的位點由一抗變成酶標記后的二抗。WANG等[20]建立了間接競爭ELISA測定豬肉樣品中的苯乙醇胺A殘留，其LOD值低于0.08 μg/kg，IC50值為0.93 pmol/mL(0.32 ng/mL)，對一些其他β-興奮劑顯示出可忽略的交叉反應性。CAO等[21]建立了間接競爭ELISA檢測組織和飼料樣品中的苯乙醇胺A，試驗結果顯示IC50和LOD值分別為0.049 ng/mL和0.003 ng/mL，3種常用的β-興奮劑(克倫特羅，沙丁胺醇和萊克多巴胺)的抗血清的交叉反應性小于0.39%，與其他6種化合物沒有交叉反應性，對豬腎、肝、肉和飼料樣品用不同含量的苯乙醇胺A強化，并通過ELISA分析，其回收率為92.2%～113.7%，分析內變異系數為3.8%～10.9%(n= 3)。

近年來，各專業性公司在ELISA 的緩沖液系統、反應條件以及包被抗原、特異性抗體、顯色系統制備、酶等方面取得了突破性的進展，使得商業化 ELISA 試劑盒在靈敏度、精密度、穩定性等方面均達到了動物性食品中藥物殘留檢測的要求。同時，ELISA方法具有儀器化程度較低、操作簡便和成本適中等優點，ELISA試劑盒已成為目前食品安全中藥殘留檢測的主流技術[22]。

EIA使用酶標記，避免了RIA的放射性污染，操作方便，靈敏度可達10-10～10-11mol/L。但仍存在不足之處，如ELISA法是固相免疫反應，抗原抗體完全反應需要1～2 h，實際操作中，需要經洗滌分離結合的和未結合的抗體，操作過程難以完全自動化。

4 化學發光免疫分析

化學發光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)化學發光法和免疫分析法兩者的特點以發光物質或酶來標記抗原或抗體，標記的抗原或抗體與待測物反應后經過理化處理(如洗滌和離心分離等步驟)加入酶底物或氧化劑而發光，通過測量化學發光強度，繪制標準曲線測定待測物的含量。根據化學發光免疫分析體所選標記物的不同，將化學發光免疫分析方法分為以下三大類：

4.1化學發光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay，CLIA)

化學發光免疫分析是化學發光試劑直接標記抗體或抗原的一種免疫測定方法。目前使用最多的是魯米諾類和吖啶酯類這兩類物質[23]。GAO等[24]通過利用萊克多巴胺和沙丁胺醇作為模型，提出了用于β-興奮劑的快速和多重測定的新的免疫層析分析法，引入了化學發光方法，所提出的方案顯示出更高的靈敏度，在最佳條件下，可以在0.50～40 ng/mL和0.10～50 ng/mL的線性范圍內分別檢測到萊克多巴胺和沙丁胺醇，LOD值分別為0.20 ng/mL和0.040 ng/mL。

4.2化學發光酶免疫分析(chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA)

CLEISA檢測原理與ELISA法基本相同，不同的是用化學發光劑代替顯色劑作為酶的底物。目前常用的標記酶是辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。WU等[25]合成沙丁胺醇-牛血清白蛋白和沙丁胺醇-卵白蛋白包被抗原，并用免疫原處理6只新西蘭白兔以獲得多克隆抗體，以開發快速、靈敏的間接化學發光酶免疫測定(CICLEIA)用于分析樣品中的β-興奮劑，在優化條件下，沙丁胺醇的線性動態范圍和LOD值分別為0.007～0.17 μg/L和0.003 μg/L，相關系數為0.996 5，最大抑制濃度為0.028 μg/L，沙丁胺醇、克倫特羅和溴布特羅的回收率分別為78.8%至119.0%。基于時間分辨可以同時檢測兩種獸藥，WANG等[26]以萊克多巴胺和克倫特羅作為目標藥物，開發了基于時間分辨化學發光策略的新型多重免疫層析測定用于β-激動劑的定量檢測，萊克多巴胺和克倫特羅的LOD值分別為0.17 ng/mL和0.067 ng/mL(S/N=3)，整個反應可以在20 min內完成。

4.3電化學發光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA)

電化學發光免疫分析是將電化學發光、免疫分析和化學分析相結合的一類化學發光免疫分析方法，是由電化學反應引起的化學發光過程。DONG[27]基于金納米粒子和L-半胱氨酸封端的CdSe量子點設計電化學發光免疫傳感器的信號放大策略，用于在K2S2O8作為共反應物的情況下高度靈敏地檢測溴布特羅，在最佳條件下，該法具有0.01～1 000 ng/mL的良好線性范圍和0.003 ng/mL的較低LOD值，還研究了該法的特異性和穩定性，其已經用于在實際樣品中測定溴布特羅，具有令人滿意的結果。CAI等[28]建立了一種超靈敏的新型電化學免疫傳感器用于沙丁胺醇的檢測，使用量子點和金納米粒子結合HRP作為電化學發光信號，LOD值為0.017 ng/mL，該法靈敏度高，重現性和選擇性好。

近年來，各種分離技術與CLIA的聯用，如流動注射化學發光免疫分析(FI-CLIA)徐明霞等[29]構建了一種酶放大的流動注射化學發光免疫傳感器分別向豬肉、豬肝樣品中加入0.5、5、20 ng/mL的沙丁胺醇標準溶液進行測定，回收率為88.6%～120.0%，相對標準偏差在9.0%以內。由于新的標記技術和發光標記物的出現，CLIA的靈敏度顯著提高，極大地促進了CLIA應用研究的發展[22]。基于磁性微粒子和金納米粒子的化學發光免疫分析的研究越來越多，在快速分離與提高靈敏度上取得突破性的進展[30]。

5 膠體金標記免疫分析

膠體金標記免疫分析(colloidal gold immunoassay，CGIA)采用納米金顆粒標記抗體，當被標記的抗體聚集達到一定程度時，出現肉眼可見的紫紅色，從而實現了對抗體和抗原反應結果的測定。LIU等[31]利用納米膠體金免疫層析試紙條檢測肉類樣品中的沙丁胺醇，LOD值是5.0 μg/kg，靈敏度較高。WU等[32]基于膠體金納米粒子的免疫層析測定法結合磁性固相萃取法用于豬肉中克倫特羅殘留的定量檢測，檢測限和定量限分別為0.10 ng/g和0.24 ng/g。由于膠體金本身具有顏色，與ELISA相比省去了顯色和終止的步驟，大大簡化了操作[33]。CGIA操作簡單、快捷迅速、安全簡便且不需任何設備和儀器。但是由于基質干擾易出現假陽性和假陰性結果，一般只能完成定性或半定量檢測，不能達到準確的定量檢測[34]，實現檢測試紙的定量、高靈敏度和多元檢測成為膠體金免疫層析技術重要的發展方向。

6 免疫芯片

免疫芯片探針(根據不同的研究目的選用抗原、抗體、受體等不同的具有生物活性的蛋白質)高密度固定于芯片上，通過特異性免疫反應捕獲樣品中的目標物[35]。SUHERMAN[36]等使用裝配有一種制備免疫傳感器芯片的表面等離子體共振傳感器檢測克倫特羅，用于制造免疫表面的最低濃度的二硫雙(琥珀酰亞胺基)丙酸酯(DSP)溶液(0.1 mmol/L)對于克倫特羅顯示出3 ppt的檢測靈敏度，是報道過的最高靈敏度。ZHENG等[37]為了方便在表面增強拉曼光譜(SERS)免疫分析中更易處理樣品，使用了3D芯片，制造了芯片上多層微流體紙基分析裝置，以向操作者提供關于不同微流體之間的相互作用的手動開關，對鹽酸克倫特羅定量檢測，LOD值為0.1 pg/mL。這種方法具有高通量、自動化、靈敏度高等其他方法所沒有的優勢。近年來，我國在免疫芯片技術領域取得了突破性的進步，已廣泛應用于食品安全檢測，具有越來越廣闊的應用前景。

7 免疫傳感器

免疫傳感器是生物傳感器的一種，是傳感器的感受器與樣品中的目標物之間發生抗原抗體的識別作用，進而產生一些物理化學變化，這些變化通過不同原理的換能器轉換成電信號或其他形式的信息輸出并記錄。WEI等[38]研究用由表面被L-半胱氨酸和戊二醛修飾的絲網印刷金電極(SPGE)構成的便攜式無標簽免疫阻抗免疫傳感器檢測克倫特羅，在優化的條件下，免疫傳感器可以檢測到1.0×10-4～1.0 mg/L(R=0.998)范圍內的克倫特羅，LOD值為2.0×10-5mg/L，加標豬肉樣品的平均回收率為92.4%～104.6%，相對標準偏差為3.6%～5.2%。ZHANG等[39]將由硫化鋅量子點和聚苯胺(ZnSQD @ PANI)組成的納米復合物與抗克倫特羅的抗體一起置于金電極上，得到檢測克倫特羅的電流型免疫傳感器，當在0.21 V(相對于Ag / AgCl)的工作電位下操作時，免疫傳感器顯示出低至5.5 pg/mL的LOD值，并且在0.01～10 ng/mL的濃度范圍內工作，與使用原始PANI相比，用ZnSQD @ PANI納米復合材料改性的電極吸收克倫特羅抗體更好，因此對克倫特羅顯示出更高的敏感性。免疫傳感器專一性強，便攜性好，且由于其具有高度的自動化、微型化和集成化，減少了對環境技術條件和使用者的依賴性。

8 流動注射免疫分析

流動注射免疫分析(flow injection chemiluminescence immunoassay，FIIA)：有兩大類型：均相流動注射免疫分析和非均相流動注射免疫分析。在獸藥殘留檢測中常將化學發光免疫分析與流動注射聯用，SONG等[40]用流注射化學發光免疫分析法檢測樣品中的克倫特羅，使用競爭性免疫測定形式，化學發光強度的降低與在0.40～120 ng/mL范圍內的克倫特羅濃度的增加成比例，相關系數為0.999(n=9)，LOD值為0.20 ng/mL。XU等[41]用流動注射-化學發光免疫分析方法測定食品中的沙丁胺醇，其LOD值為0.15 ng/mL，該方法具有良好的穩定性、特異性和重復性，應用于實際樣品，結果令人滿意。FIIA可以大大縮短測定時間，節約免疫試劑，并且方便自動化。

9 免疫PCR

免疫PCR(immuno-PCR，IPCR)1992年SANO等[42]將ELISA和PCR技術結合在一起建立了一種新型的檢測技術即IPCR。戴明雁[43]在酶聯免疫方法的基礎上，用熒光定量PCR作為信號檢測手段，建立實時定量IPCR法檢測萊克多巴胺。該方法的LOD值為0.003 9 ng/mL，IC50=0.18 ng/mL，與ELISA方法相比，靈敏度提高了2個數量級，在萊克多巴胺濃度為0.25～1.0 ng/mL時，板內回收率在80%～120%，板內及板間變異系數小于10%。LEI[44]等研究一種新的以預組裝DNA免疫探針為基礎的IPCR方法檢測樣品中的沙丁胺醇，在優化條件下，檢測結果顯示線性范圍超過7個數量級，在標準緩沖液中沙丁胺醇的檢測限為21 fg/mL，與使用相同抗體的直接競爭性ELISA相比，靈敏度提高300倍。IPCR技術應用對象廣泛，大大提高了檢測的靈敏度和準確度，因此在獸藥殘留檢測中將會有更深入的研究。

10 其他免疫方法

近年來科研工作者不斷研究開發新的免疫分析方法檢測食品中β-興奮劑殘留，CHENG等[45]將聚集的氧化石墨烯/金納米顆粒雜化物的SERS與免疫磁珠樣品制備方法結合，開發了確定動物尿中克倫特羅含量的高靈敏度方法，檢測時間僅需15 min/樣品，尿液中的檢測限和定量限分別為0.5 ng/mL和1 ng/mL，回收率為82.8%～92.4%，變異系數小于9.4%，檢測的日常變化小于6.41%。WANG等[46]開發了基于上轉換熒光體(UCP)用于定量檢測克倫特羅的新型的、超靈敏的免疫層析測定傳感器，感應結果可在10 min內獲得，在優化的條件下，該傳感器對克倫特羅的視覺檢測限(VLOD)為0.1 ng/mL，使用該傳感器可以實現低至0.01 ng/mL的克倫特羅的計算檢出限(CLOD)。各種樣品基質中克倫特羅的回收率為73.0%～92.2%，相對標準偏差低于12%。

11 多組分殘留

近年來人們更趨向于研究將檢測范圍由單一檢測轉向多殘留檢測，多殘留檢測既指同時檢測一類獸藥中的幾種，又指同時檢測幾類獸藥，上文已涉及幾種多殘留檢測的方法，如：以時間分辨為基礎的化學發光免疫法等。除此之外還有一些其他免疫分析方法，WANG等[47]開發了一種靈敏的、定量的熒光多組分免疫色譜傳感器用于檢測克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇3種β-興奮劑殘留，反應時間僅為10 min，克倫特羅，萊克多巴胺和沙丁胺醇的LOD值分別為0.10、0.10和0.09 ng/mL，回收率范圍為70.0%～100.5%，相對標準偏差低于15%。HAN等[48]開發多重浸漬免疫測定法同時測定牛奶，尿液和血清中的多種獸藥殘留，如β-興奮劑，磺胺類藥物和四環素，樣品不需要預處理并且可以在10 min內直接分析，肉眼估計不同樣品基質中克倫特羅、磺胺嘧啶和四環素的閾值水平分別為0.3～0.45 ng/mL、3～4 ng/mL和4.5～6 ng/mL，加標樣品中克倫特羅，磺胺嘧啶和四環素的回收率為78.4%～112.6%，相對標準偏差低于11.2%。

12 結語

盡管自“瘦肉精事件”后，國家對β-興奮劑類獸藥殘留加大了監管力度，檢測方法也有了突破性進展，但非法使用的現象還時有發生，由于免疫分析技術仍存在一定的問題和局限，尚待進一步發展和完善，所以將其應用于β-興奮劑類獸藥殘留的檢測仍須科研人員的不懈努力。食品是一個復雜的體系，小分子藥物也具有多樣性，檢測時需要多種技術的聯合使用，取長補短，獲得單一分析技術難以達到的效果，追求更高的檢測通量、靈敏度、特異性和更低的檢測限。在科研人員的共同努力下，免疫分析法會在β-興奮劑類藥物殘留檢測中發揮更大的應用價值，為保障動物性食品安全全做出更大的貢獻。

[1] SALPETER S R,BUCKLEY N S,ORMISTON T M,et al．Meta-analysis: effect of long-acting β-agonists on severe asthma exacerbations and asthma-related deaths[J]．Annals of Internal Medicine,2006,144(12):904-912.

[2] SEARS M R．Adverse effects of beta-agonists[J]．The Journal of Allergy And Clinical Immunology,2002,110(6): S332-328.

[3] 翟福麗,賴克強,張衍亮,等．動物性食品中β-興奮劑殘留概述[J]．食品科學,2011,32(5): 351-356.

[4] Council Directive 96/22/EC,Concerning the prohibition on the use in stockfarming of certain substances having a hormonal or thyrostatic action and of β-agonists,and repealing Directives 81/602/EEC,88/146/EEC and 88/299/EEC[S].

[5] 中華人民共和國農業部．農業部公告第235號動物性食品中獸藥最高殘留限量[S]．北京: 中國標準出版社,2002.

[6] YALOW R S,BERSON S A．Assay of plasma insulin in human subjects by immunological methods[J]．Nature,1959,184: 1 648-1 649.

[7] GRANJA R H M M,NINO A M M,RABONE F,et al．Validation of radioimmunoassay screening methods for -agonists in bovine liver according to Commission Decision 2002/657/EC[J]．Food Additives And Contaminants Part A Chemistry Analysis Control Exposure & Risk Assesment,2008,25(12): 1 475-1 481.

[8] 呂珍珍,蔣小玲,劉金釧,等．免疫分析技術在獸藥殘留檢測中的應用[J]．農產品質量與安全,2012,S1: 76-79.

[9] 袁利鵬,楊金易,徐振林,等．熒光偏振免疫分析法檢測沙丁胺醇[J]．食品科學,2013,34(16): 139-142.

[10] 楊代鳳,劉騰飛,鄧金花,等．標記免疫分析在農獸藥殘留檢測中的應用研究進展[J]．中國農學通報,2012,28(30): 218-225.

[11] 侯文慧．沙丁胺醇銪標記時間分辨熒光免疫分析方法的建立[J]．食品研究與開發,2016,37(7): 154-160.

[12] 史聰穎．萊克多巴胺新型免疫熒光猝滅檢測技術研究[D]．廣州: 暨南大學,2014: 5-54.

[13] ZHANG G G,CHEN M H,LIU D F,et al．Quantitative detection of beta(2)-adrenergic agonists using fluorescence quenching by immunochromatographic assay[J]．Analytical,2016,8(3): 627-631.

[14] 潘明飛,王俊平,方國臻,等．食品中農獸藥殘留檢測新技術研究進展[J]．食品科學,2014,35(15): 277-282.

[15] WANG S B,ZHANG Y,WEI Y L,et al．Fluoroimmunoassay and magnetic lateral flow immunoassay for the detection of ractopamine[J]．Spectroscopy And Spectral Analysis,2015,35(11): 3 100-3 104．

[16] ZHOU C H,YUAN H,WANG X,et al．CdSe/ZnS quantum dots with multi-shell protection: synthesis and application in the detection of ractopamine residue in swine urine[J].Science of Advanced Materials,2013,5(3): 285-294.

[17] 蘇茂．畜禽產品獸藥殘留的免疫學檢測方法探討[J].南方農業,2016,10(12): 192,194.

[18] ENGVALL E,PERLMANN P．Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G[J]．Immunochemistry,1971,8(9): 871-874.

[19] DU H J,CHU Y X,YANG H,et al．Sensitive and specific detection of a new beta-agonist brombuterol in tissue and feed samples by a competitive polyclonal antibody based ELISA[J]．Analytical Methods,2016,8(17): 3 578-3 586.

[20] WANG X M,LIUFU T L,BELOGLAZOVA N V,et al．Development of a competitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay for screening phenylethanolamine a residues in pork samples[J]．Food Analytical Methods,2016,9(11): 3 099-3 106.

[21] CAO B Y,HE G Z,YANG H,et al．Development of a highly sensitive and specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of phenylethanolamine a in tissue and feed samples and confirmed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)[J]．Talanta,2013,115: 624-630.

[22] 張素霞．獸藥殘留分析技術研究進展[J]．動物保健,2005,9: 30-33.

[23] 金茂俊,王靜,楊麗華,等．化學發光免疫分析方法在食品安全檢測中的研究進展[J]．食品安全質量檢測學報,2014,5(3): 840-845.

[24] GAO H F,HAN J,YANG S J,et al．Highly sensitive multianalyte immunochromatographic test strip for rapid chemiluminescent detection of ractopamine and salbutamol[J]．Analytical Chimica Acta,2014,839: 91-96.

[25] WU Y P,XU F,JIANG H Y,et al．Determination of salbutamol,clenbuterol,and brombuterol in urine by a highly sensitive chemiluminescence enzymeimmunoassay[J]．Analytical Letters,2014,47(16): 2 761-2 773.

[26] WANG W W,SU X X,OUYANG H,et al．A novel immunochromatographic assay based on a time-resolved chemiluminescence strategy for the multiplexed detection of ractopamine and clenbuterol[J]．Analytical Chimica Acta,2016,917: 79-84.

[27] DONG T T,YANGXIAO K,ZHAO K et al．Signal amplification strategy for highly sensitive detecting brombuterol with electrochemiluminescent immunoassay by using CdSe QDs as label and gold nanoparticle as substrate[J]．Electroanalysis,2016,28(8): 1 847-1 855.

[28] CAI F D,WANG N,DONG T T,et al．Dual-signal amplified electrochemiluminescence immunoassay for salbutamol based on quantum dots and gold nanoparticle-labeled horseradish peroxidase[J].Analyst,2015,140(17): 5 885-5 890.

[29] 徐明霞．酶放大的流動注射化學發光免疫傳感器的構建及在食品違禁添加劑中的應用[D]．蘇州: 蘇州大學,2016: 1-52.

[30] XIAO Q,LIN J M．Advances and applications of chemiluminescence immunoassay in clinical diagnosis and foods safety[J]．Chinese Journal of Analytical Chemistry,2015,43(6): 929-938.

[31] LIU B,WANG L L,TONG B,et al．Development and comparison of immunochromatographic strips with three nanomaterial labels: Colloidal gold,nanogold-polyaniline-nanogold microspheres (GPGs) and colloidal carbon for visual detection of salbutamol[J]．Biosensors & Bioelectronics,2016,85: 337-342.

[32] WU K S,GUO L,XU W,et al．Sulfonated polystyrene magnetic nanobeads coupled with immunochromatographic strip for clenbuterol determination in pork muscle[J]．Talanta,2014,129: 431-437.

[33] 杜兵耀,臧長江,馬晨,等．免疫學技術在牛奶檢測中應用的研究進展[J]．中國畜牧獸醫,2016,43(2): 457-461.

[34] 張銘潤,張燕,王弘,等．食品污染物殘留的快速檢測技術應用綜述及展望[J]．食品安全質量檢測學報,2014,5(7): 1 951-1 959.

[35] 曲信芹,凌紅麗,蔣貽海,等．免疫芯片技術在獸藥殘留檢測中的應用[J]．中國動物檢疫,2015,32(10): 21-24.

[36] SUHERMAN,MORITA K,KAWAGUCHI T．Surfaceplasmon resonance for detecting clenbuterol: Influence of monolayer structure[J]．Applied Surface Science,2015,332: 229-236.

[37] ZHENG T T,GAO Z G,LUO Y,et al．Manual-slide-engaged paper chip for parallel SERS-immunoassay measurement of clenbuterol from swine hair[J]．Electrophoresis,2016,27(3): 418-424.

[38] WEI L H,LIU L,KANG H M,et al．Development of a disposable label-free impedance immunosensor for direct and sensitive clenbuterol determination in pork[J]．Food Analytical Methods,2016,9(6): 1 781-1 788.

[39] ZHANG Z H,DUAN F H,HE L H,et al．Electrochemical clenbuterol immunosensor based on a gold electrode modified with zinc sulfide quantum dots and polyaniline[J]．Microchimica Acta,2016,183(3): 1 089-1 097.

[40] SONG J,XU M,ZHAO K,et al．Flow injectionchemiluminescence immunosensor for the determination of clenbuterol by immobilizing coating-antigen on carboxylic resin beads[J]．Analytical Methods,2014,6(9): 3 152-3 158.

[41] XU M X,QIAN X L,ZHAO K,et al．Flow injection chemiluminescent competitive immunoassay for the beta-adrenergic agonist salbutamol using carboxylic resin beads and enzymatic amplification[J]．Sensors And Actuators B-Chemical,2015,215: 323-329.

[42] SANO T,SMITH C L,CANTOR C R．Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates[J]．Science,1992,258(5 079): 120-122.

[43] 戴明雁．萊克多巴胺免疫PCR檢測方法學基礎研究[D]．杭州: 中國計量學院,2015： 1-77.

[44] LEI Y J,LI X Y,AKASH M S H,et al．Development of analytical method for ultrasensitive detection of salbutamol utilizing DNA labeled-immunoprobe[J]．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2015,107: 204-208.

[45] CHENG J,SU X O,WANG S,et al．Highly sensitive detection of clenbuterol in animal urine using immunomagnetic bead treatment and surface-enhanced raman spectroscopy[J]．Scientific Reports,2016,6: 1-10.

[46] WANG P L,WANG R G,ZHANG W,et al．Novel fabrication of immunochromatographic assay based on up conversion phosphors for sensitive detection of clenbuterol[J].Biosensors& Bioelectronics,2016,77: 866-870.

[47] WANG P L,WANG Z,SU X O．A sensitive and quantitative fluorescent multi-component immuno-chromatographic sensor for beta-agonist residues[J]．Biosensors & Bioelectronics,2015,64: 511-516.

[48] HAN S J,ZHOU T J,YIN B J,et al．A sensitive and semi-quantitative method for determination of multi-drug residues in animal body fluids using multiplex dipstick immunoassay[J]．Analytica Chimica Acta,2016,927: 64-71．

Immunoassaysfordeterminationofβ-agonistsresiduesinanimal-derivedfood

LIU Shuo,TAO Xiao-qi*

(College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China)

The beta-agonists can reduce animals’ fat content,promote protein synthesis,improve the ratio of lean muscle and increase feed efficiency.Hence,it is often used as a feed additive.However,because the beta-agonists residues can still remain in animal tissues,it causes heart palpitations,headaches,liver and kidney poisoning and other serious harm to human being.Most countries including China,have banned the use of beta-agonists in animal products.Nowadays,the various detection methods of beta-agonists residues in animal-derived food have been reported.This paper mainly introduces the principles,advantages and disadvantages,the research progress and development trend of immunoassay methods,including radioimmunoassay,enzyme immunoassay,chemiluminescence immunoassay,fluorescent immunoassay,colloidal gold immunoassay,immunosensor,immunochip,flow injection chemiluminescence immunoassay and immuno-PCR. This article provides a reference for the fatrge development.

β-agonists; immunoassay; animal-derived food

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013744

本科生(陶曉奇副教授為通訊作者,E-mail:77179000@qq.com)。

國家自然科學基金面上項目(31672605)；中國博士后科學基金面上資助(2016M590855)

2017-01-03，改回日期：2017-03-28