以豆粕為基質的植物乳桿菌固態發酵菌劑的制備

王彥萍，熊濤，王浩，彭珍，黃濤

(南昌大學 食品學院食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

以豆粕為基質的植物乳桿菌固態發酵菌劑的制備

王彥萍，熊濤*，王浩，彭珍，黃濤

(南昌大學 食品學院食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

研究了以豆粕(添加2%葡萄糖)為基質的植物乳桿菌固態發酵菌劑制備的最佳條件。以干燥后活菌數為指標，通過單因素和Box-Behnken響應面實驗設計對發酵工藝進行優化，對豆粕發酵前后的主要營養成分及抗營養因子含量進行測定，并最終確定了烘干條件。結果表明，在發酵溫度30.6 ℃、接種量4.45%、加水比1∶0.61、發酵時間46.40 h時，活菌數為最高達到9.94 lg(CFU/g)；粗蛋白、酸溶蛋白、游離氨基酸總量和蛋白質消化率較發酵前分別提高了4.55%、1.24%、50.47 mg/g和4.21%；胰蛋白酶抑制因子、脲酶和植酸較發酵前分別降低了94.59%、91.64%和30.22%；最佳干燥條件為熱風干燥50 ℃、4 h，菌劑活菌總數為9.88 lg(CFU/g)。

植物乳桿菌；豆粕；固態發酵；Box-Behnken試驗

近年來，在畜禽養殖中抗生素的長期和過度使用所帶來的問題越來越引起人們的重視，抗生素的殘留給畜牧養殖業的發展、人類健康和環境帶來很大的危害，尋找安全、綠色、有效的抗生素替代品變得越來越迫切[1-2]。益生菌制劑被認為是最有前景的抗生素替代品之一，具有改善動物生產性能、提高機體免疫力、維持腸道微生態平衡等功能，其中乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌是應用最多的理想菌種[3]。越來越多的研究證實，乳酸菌發酵飼料代替飼用抗生素具有很好的應用前景[4-5]。豆粕作為一種良好的植物性蛋白質飼料原料，具有蛋白含量高，氨基酸平衡等優點，但其中含有的多種抗營養因子影響豆粕的使用價值[6-7]。

本研究以豆粕為發酵基質，通過響應面實驗設計，以活菌數為指標對發酵條件進行優化，并且對豆粕發酵前后的各項指標進行了比較。在制備高活性乳酸菌菌劑的同時，除去豆粕中部分抗營養因子，提高豆粕的營養價值[8]，為微生物發酵飼料替代抗生素提供技術支持。

1 材料與方法

1.1菌種與材料

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) NCU156，由南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室保藏，豆粕購于市場。

1.2試劑

鹽酸、乙酸鈉、檸檬酸三銨，天津市永大化學試劑；氫氧化鈉，西隴化工股份有限公司；胃蛋白酶(酶活力1∶10 000),美國Sigma公司；胰蛋白酶(酶活力1∶250)，美國Amresco公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母膏，廣東環凱生物科技有限公司；MgSO4、吐溫80，上海市青析化工科技有限公司；均為分析純試劑。

MRS培養基：采用GB 4789.35—2010 《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[9]方法配置。

1.3儀器與設備

GNP型隔水式恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計。北京普析通用儀器有限責任公司；YXQ-LS-50SⅡ/75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；K9840型自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；S433D-全自動氨基酸分析儀，賽卡姆科學儀器有限公司。

1.4實驗方法

活菌數的測定[10]：準確稱取1.0 g豆粕于9 mL無菌生理鹽水中，振蕩混勻、梯度稀釋、涂布于MRS固體培養基上，將平板置于37 ℃恒溫培養箱培養48 h后進行菌落計數。

1.4.1 發酵條件單因素實驗

1.4.1.1 發酵時間

在加水比1∶0.6，發酵溫度37℃，接種量4%的條件下，分別發酵0、24、48、72、96 h，發酵結束后烘干、過篩，測活菌數。

1.4.1.2 發酵溫度

在加水比1∶0.6，接種量4%的條件下，分別在28、32、37、42 ℃下發酵48 h，發酵結束后烘干、過篩，測活菌數。

1.4.1.3 加水比

在發酵溫度37 ℃，接種量4%、發酵時間48 h的條件下，分別設定加水比為1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0，發酵結束后烘干、過篩，測活菌數。

1.4.1.4 接種量

在發酵溫度37 ℃，加水比1∶0.6，發酵時間48 h的條件下，分別按2%、4%、6%、8%的接種量接種，發酵結束后烘干、過篩，測活菌數。

1.4.2 響應面法優化發酵條件

在單因素實驗的基礎上，分別對每個因素選取低、中、高3個水平，利用實驗設計軟件design-expert8.06中的Box-Behnken設計方案，以豆粕中活菌數為響應值，采用4因素3水平的響應面分析法對發酵工藝條件進行進一步的優化。

1.4.3 發酵前后營養成分分析

粗蛋白含量的測定[11]：采用國家標準GB/T6432—1994飼料中粗蛋白測定方法；酸溶蛋白含量的測定[12]：采用QB/T 2653—2004大豆肽粉行業標準；游離氨基酸含量的測定[13]：參照李琪等方法進行測定；蛋白質消化率的測定[14]：參照S.BOISEN等胃蛋白酶-胰酶兩步法進行測定；胰蛋白酶抑制因子的測定[15]：樣品處理及含量測定采用華蕾分光光度法進行測定；豆粕脲酶活性測定[16]：采用國家標準GB/T 8622—2006飼料用大豆制品中尿素酶活性的測定方法；植酸含量的測定[17]：采用劉海燕測鐵分光光度法進行測定。

1.4.4 干燥條件的研究

采用熱風干燥和真空干燥兩種方法，分別在40、50、60 ℃條件下干燥10 h，每隔2 h取樣進行活菌數和水分含量的測定。

水分含量測定方法[18]：采用國家標準GB/T 6435—2014飼料中水分的測定。

2 結果與分析

2.1發酵條件單因素實驗

2.1.1 發酵時間的確定

結果如圖1所示，隨著發酵時間的延長，活菌數呈現先升高后降低的趨勢，在第48 h活菌數達到最高為9.83 lg(CFU/g)，48 h以后進入衰亡期菌數開始下降，選擇的最佳發酵時間為48 h。

圖1 發酵時間對植物乳桿菌NCU156生長的影響Fig.1 Effect of time on cultivation of L.plantarum NCU156注：所有圖中標有相同字母者表示差異不顯著(p<0.05)，沒有相同字母者表示差異顯著(p>0.05)

2.1.2 發酵溫度的確定

如圖2所示，隨著發酵溫度的升高，植物乳桿菌NCU156活菌數先升高后降低，在溫度為32℃時活菌數達到最大。溫度較低或較高都會影響菌體的生長，適當的低溫培養可以增加細胞內熱應激蛋白的表達，產生較多的不溶性多糖和不飽和脂肪酸，減少烘干過程中菌體的死亡[19-20]。溫度過低會延長發酵時間，故選擇的最適發酵溫度為32 ℃。

圖2 發酵溫度對植物乳桿菌NCU156生長的影響Fig.2 Effect of temperature on cultivation of L.plantarum NCU156

2.1.3 加水比的確定

實驗結果如圖3所示，隨著加水比的增加，活菌數的變化趨勢為先增加后減少，在加水比為1∶0.6的條件下活菌數最高，選擇的加水比為1∶0.6。

圖3 加水比對植物乳桿菌NCU156生長的影響Fig.3 Effect of ratio of solid to liquid on cultivation of L.plantarum NCU156

2.1.4 接種量的確定

接種量的大小決定發酵過程中微生物的增長速度，適宜的接種量可以縮短發酵周期。接種量過大會過多的接入代謝廢物，造成培養基pH的降低等影響微生物生長；接種量過低則會延長發酵周期，降低發酵效率[21]。接種量對植物乳桿菌NCU156的影響如圖4所示，在接種量為4%的條件下植物乳桿菌活菌數最高，達到9.91 lg(CFU/g)，故選擇的接種量為4%。

圖4 接種量對植物乳桿菌NCU156生長的影響Fig.4 Effect of inoculation quantity on cultivation of L.plantarum NCU156

2.2響應面法優化發酵條件

在單因素實驗的基礎上，以發酵時間(A)、接種量(B)、加水比(C)、發酵溫度(D)為4個因素自變量，植物乳桿菌NCU156活菌數的對數值為響應值，通過 Design-expert 軟件設計4因素3水平的BOX-Behnken試驗，實驗因素水平表如表1，試驗設計和結果如表2所示。

表1 響應面分析因素水平表

通過Design-Expert 8.06軟件進行數據分析，建立多元二次回歸模型方程，回歸方程方差分析見表3，由表3可知：發酵時間(A)、發酵溫度(D)、加水比(C)對NCU156的活菌數影響顯著(p<0.05)，發酵時間與加水比，加水比與發酵溫度交互作用明顯(p<0.05)。得到的回歸方程如下：

表2 BOX-Behnken試驗設計及結果

表3 回歸模型方差分析

注：*.p<0.05，差異顯著；**.p< 0.01，差異極顯著。

Y=9.92-0.10×A+0.059×B-0.088×C-0.094×D+0.073×AB-0.21×AC-0.36×CD-0.73×A2-0.12×B2-0.29×C2-0.20×D2

式中：Y,活菌數的響應值。

由方差分析結果可知，回歸模型F-檢驗極顯(pmodel<0.01)，失擬項在α=0.05水平上不顯著(p=0.054 5>0.05)，其決定系數R2=0.961 1，表明此模型擬合度良好，可以用于植物乳桿菌NCU156固態發酵的理論預測。

由擬合方程可繪制不同因素之間的響應面分析圖及相應的等高線圖如圖5(a-f)，由圖5可較直觀地看出各因素間的交互作用對植物乳桿菌NCU156活菌數的影響，由方差顯著性分析及圖5-b和圖5-d可以看出溫度與加水比以及加水比與時間交互作用明顯。通過軟件分析確定植物乳桿菌NCU156菌劑制備最佳工藝條件為：發酵溫度30.6 ℃、接種量4.45%、加水比1∶0.61、發酵時間46.40 h，預測活菌數達到9.938 lg(CFU/g)。根據優化后的實驗條件進行3次驗證實驗，得活菌數為9.945lg(CFU/g)，與模型預測基本吻合。

圖5 兩因素交互作用對植物乳桿菌NCU156活菌數響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plot for the effect of operating parameters on the viable counts of L.plantarun NCU156

2.3發酵前后營養成分分析

2.3.1 豆粕發酵前后粗蛋白、酸溶蛋白、粗蛋白消化率的比較

豆粕發酵前后成分變化見表4。發酵后粗蛋白含量較發酵前提高了4.55個百分點， 這主要是因為發酵過程中乳酸菌消耗了部分有機物料，使發酵基質總量減少，出現了蛋白質的“濃縮效應”，同時微生物大量增殖將基質中非蛋白氮利用轉化為自身的菌體蛋白[22]；酸溶蛋白和粗蛋白消化率分別由發酵前的1.09%和80.39%提高到2.33%和84.60%，說明豆粕在發酵過程中大分子蛋白被分解為小分子多肽或氨基酸更易被消化利用[23]。

2.3.2 豆粕發酵前后抗營養因子的變化

大豆中含有多種抗營養因子嚴重影響動物對營養物質的消化吸收，其中大豆胰蛋白酶抑制因子、凝集素和植酸等的抗營養作用較強，其發酵前后含量變化如表4所示。胰蛋白酶抑制因子由發酵前的0.37 mg/g降低至0.02 mg/g，減少了94.59%，降低水平較HONG[24]等報道更高；脲酶活性由發酵前39.70 U/g降低至發酵后的3.32 U/g，活性減少了91.64%；植酸含量由發酵前17.54 mg/g降低至12.24 mg/g，減少了30.22%，與胰蛋白酶抑制因子和脲酶相比降解程度較低，表明乳酸菌對植酸的降解作用有限，這與STALE[25]等研究結果一致。

2.3.3 豆粕發酵前后游離氨基酸含量變化

在發酵過程中，微生物代謝產生的一些酶類物質可以將豆粕中大分子蛋白降解為小肽甚至氨基酸，使豆粕中氨基酸組成及含量發生變化[26]，豆粕發酵前后游離氨基酸變化如表5所示。

表5 豆粕發酵前后游離氨基酸含量

發酵后所測得的所有游離氨基酸較發酵前都有所增加，其中含量增加較多的氨基酸有甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和脯氨酸，分別是發酵前的25倍、48倍、61倍和16倍，豆粕中第一限制性氨基酸賴氨酸較發酵前提高了3.3倍，游離氨基酸總量較發酵前提高了14.5倍。表明通過乳酸菌發酵能夠顯著提高豆粕中游離氨基酸含量，提高豆粕的營養品質及飼用價值。

2.4干燥條件的研究

工業生產中，固態發酵活菌制劑一般使用真空干燥、鼓風干燥和流化床干燥等方式進行處理。圖6為植物乳桿菌菌劑在不同溫度條件下進行熱風干燥和真空干燥的干燥曲線。在同一干燥方式下，隨著干燥溫度的升高，干燥過程中活菌數下降越明顯，40、50 ℃和60 ℃條件下熱風干燥10 h最終活菌數分別為9.56、8.96和8.87 lg(CFU/g)，真空干燥下活菌數分別為9.12、6.49和6.13 lg(CFU/g)，說明隨著溫度的升高菌的死亡率增大，這主要是由于高溫造成細胞內重要組分的失活導致細胞死亡[27]；在同一干燥溫度條件下，熱風干燥的失水速率明顯大于真空干燥，干燥終點物料的水分含量較真空干燥更低，而活菌數卻比真空干燥高，這與TYMCZYSZYN[28]等研究發現一致干燥速率越慢獲得的存活率越低。有研究表明相對于失水失活熱應力更易造成不可逆轉的損傷，所以在考慮降低水分含量的同時應盡可能的縮短干燥時間減少菌數的損失，綜合考慮選擇的干燥條件為50 ℃熱風干燥4 h，物料最終水分含量為5.12%，活菌數為9.88 lg(CFU/g)。

▲和△分別為熱風干燥活菌數和水分含量；●和○分別為真空干燥活菌數和水分含量圖6固態發酵植物乳桿菌在不同溫度下干燥曲線Fig.6 Drying curve of solid-state fermented L.plantarun NCU156 under different temperature

3 結論

本研究以豆粕為發酵基質探討了植物乳桿菌NCU156菌劑制備的生產工藝，最終確定了適宜的工藝條件為：接種量4.45%、加水比1∶0.61，30.6 ℃發酵46.40 h，發酵結束后50 ℃熱風干燥4 h。在優化的工藝條件下，植物乳桿菌NCU156固態發酵菌劑活菌數達到9.88 lg(CFU/g)，水分含量5.12%。乳酸菌固態發酵豆粕在提高豆粕中粗蛋白、酸溶蛋白、游離氨基酸總量和蛋白質體外消化率的同時，還能降解大部分胰蛋白酶抑制因子、脲酶和部分植酸，這與劉海燕[17]研究結果一致。使用豆粕做為發酵基質制備乳酸菌菌劑的同時，還能夠提高豆粕的營養價值，為乳酸菌發酵飼料替代抗生素提供支持。

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Optimizationofsolid-statecultureconditionsforLactobacillusplantarumagentutilizingsoybeanmealasnitrogensource

WANG Yan-ping, XIONG Tao*, WANG Hao, PENG Zhen, HUANG Tao

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Institute of Food Sciences of Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Research herein was focused on the best condition for preparation ofLactobacillusplantarumagent with soybean meal containing 2% glucose. The number of viable cells after drying was used as an indicator to investigate the production process. The production process was optimized through one-factor experiment combined with response surface methodology. After fermentation, content of crude protein, acid soluble protein, free amino acids, trypsin inhibitor, urease, and phytic acid, as well as protein digestibility were determined. Results showed thatLactobacillusplantarumachieved the highest biomass after incubation at 30.6 ℃ for 46.40 h, with substrate to water ratio of 1∶0.61 and inoculum concentration of 4.45%. The content of crude protein, acid soluble protein, and total free amino acids, and protein digestibility were increased 4.55%, 1.24%, 50.47 mg/g and 4.21% respectively. The content of trypsin inhibitor, urease, and phytic acid were decreased 94.59%, 91.64%, and 30.22%, respectively. The number ofLactobacillusplantarumcould reach 9.88 lg(CFU/g) under the best drying condition of 50℃ hot air for 4 h.

Lactobacillusplantarum; soybean meal; solid-state fermentation; Box-Behnken experimental design

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013517

碩士研究生(熊濤教授為通訊作者,E-mail:xiongtao0907@163.com)。

江西省主要學科學術和技術帶頭人培養計劃(20133BCB22001)；江西省重大科技專項計劃(贛財教字 [2014]104號)；“贛鄱英才555工程”領軍人才培養計劃(贛才字[2013]2號)；江西省蔬菜產業技術體系崗位專家項目(JXARS-06)

2016-11-29，改回日期：2017-01-04