低強(qiáng)交變磁場(chǎng)促進(jìn)灰樹(shù)花液體發(fā)酵及其生物學(xué)窗效應(yīng)研究

李心怡，葉曉非，馬海樂(lè)，劉偉民，孫玲，孔娜

(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇省食品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)

低強(qiáng)交變磁場(chǎng)促進(jìn)灰樹(shù)花液體發(fā)酵及其生物學(xué)窗效應(yīng)研究

李心怡，葉曉非*，馬海樂(lè)，劉偉民，孫玲，孔娜

(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇省食品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)

使用實(shí)驗(yàn)室自制磁場(chǎng)搖床，以灰樹(shù)花為研究對(duì)象，通過(guò)改變交變磁場(chǎng)作用各參數(shù)條件，研究其對(duì)灰樹(shù)花菌絲體生長(zhǎng)促進(jìn)效果的影響，并借助發(fā)酵液pH值的變化對(duì)窗效應(yīng)的發(fā)生原因進(jìn)行了初步探討。通過(guò)掃描電鏡、紅外光譜、一般性化學(xué)成分分析等手段，對(duì)比常規(guī)液態(tài)發(fā)酵和磁場(chǎng)輔助液態(tài)發(fā)酵所得菌絲體的差別。研究表明，當(dāng)磁感應(yīng)強(qiáng)度為35 Gs、初次磁處理介入時(shí)間為接種后1 h、作用時(shí)長(zhǎng)為3 h時(shí)，磁場(chǎng)對(duì)灰樹(shù)花菌絲體的生長(zhǎng)促進(jìn)作用最強(qiáng)，灰樹(shù)花的菌絲體干質(zhì)量提高率達(dá)11.43%，各營(yíng)養(yǎng)成分總量均有所上升。在磁場(chǎng)處理時(shí)長(zhǎng)為3 h和5 h時(shí)，出現(xiàn)了磁場(chǎng)促進(jìn)灰樹(shù)花生長(zhǎng)的“生物學(xué)窗效應(yīng)”。

灰樹(shù)花；液體發(fā)酵；交變磁場(chǎng)；窗效應(yīng)

灰樹(shù)花(Grifolafrondosa，G.frondosa) 又名貝葉多孔菌(Polyporusfrondosa)、千佛菌、蓮花菌等，是一種擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌屬的高檔藥、食兩用真菌，其子實(shí)體脆嫩鮮美，味如雞絲，干菇具有獨(dú)特香氣[1]。現(xiàn)有研究表明，在諸多生物活性物質(zhì)中，富含 β-1,6-及 β-1,3-糖苷鍵的灰樹(shù)花多糖(特別是灰樹(shù)花D組分)被認(rèn)為是其最主要的活性成分，具有降血糖[2]、降血脂[3]、降膽固醇[4]，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力[5]，抗腫瘤[6]等效用。此外對(duì)灰樹(shù)花浸膏粉的化學(xué)成分分析，其菌絲體亦富含蛋白、氨基酸、微量元素、維生素等營(yíng)養(yǎng)元素[7]。

灰樹(shù)花于1965年左右由日本研究人員首次人工栽培成功，因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極受推崇，被譽(yù)為“食用菌王子”。我國(guó)的首次栽培記錄于1983年，浙江、河北、福建、四川等地栽培較多，是中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)認(rèn)可的保健食品原料，是WHO和FAO組織向發(fā)展中國(guó)家推薦的名貴經(jīng)濟(jì)品種，近年來(lái)受到極大關(guān)注。現(xiàn)已開(kāi)發(fā)多種保健品，如：“灰樹(shù)花膠囊(麥特消)”(國(guó)藥準(zhǔn)字B20020023)、“維吉爾膠囊”(衛(wèi)食健字(2003)第0320號(hào))、MAIEXT(日本)以及Grifron系列產(chǎn)品(美國(guó))等[8]。

目前我國(guó)灰樹(shù)花工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)仍較為原始，基本采用固體菌種直接出菇的方法，灰樹(shù)花多糖的提取也依賴(lài)于子實(shí)體，但該方法原料品質(zhì)及環(huán)境條件難以控制，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，占地面積大，產(chǎn)量不穩(wěn)定，易受雜菌污染，屬于勞動(dòng)密集型產(chǎn)業(yè)。相比固體培養(yǎng)，食用菌液體深層培養(yǎng)具有原料來(lái)源廣泛，周期短，品質(zhì)產(chǎn)量穩(wěn)定，環(huán)境條件易于控制，少雜菌污染等優(yōu)點(diǎn)[9]，深層發(fā)酵的發(fā)酵液還可用于提取多種代謝產(chǎn)物如真菌多糖、氨基酸、多肽等，提高原料利用率。故國(guó)內(nèi)外對(duì)灰樹(shù)花的液態(tài)深層發(fā)酵研究逐漸增多，主要通過(guò)篩選誘變菌種、優(yōu)化培養(yǎng)條件、添加無(wú)機(jī)微粒子等方法提高灰樹(shù)花液體發(fā)酵效率，但該類(lèi)方法只能針對(duì)某種特定的菌種，無(wú)法普遍適用，研究成本高、耗時(shí)長(zhǎng)。

物理學(xué)方法在食品加工領(lǐng)域的主要應(yīng)用包括食品分離、食品加工、食品非熱加工、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)快速檢測(cè)等[10]，早期應(yīng)用在微生物發(fā)酵中相對(duì)較少，低頻交變磁場(chǎng)的應(yīng)用更不常見(jiàn)。生物磁學(xué)作為一門(mén)新型邊緣學(xué)科，近年來(lái)研究逐漸深入，出現(xiàn)了利用磁場(chǎng)(穩(wěn)恒磁場(chǎng)、低頻交變磁場(chǎng))促進(jìn)微生物生長(zhǎng)或促進(jìn)某種微生物代謝產(chǎn)物合成的研究。目前研究者已發(fā)現(xiàn)磁場(chǎng)可以促進(jìn)平菇的生長(zhǎng)，在菌體數(shù)量、色澤、整齊度方面均能有所提高[11]。高夢(mèng)祥等[12-13]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)一定條件下的交變磁場(chǎng)對(duì)啤酒酵母、猴頭菌等菌種的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。王蓓等[14]研究發(fā)現(xiàn)，靜磁場(chǎng)可顯著促進(jìn)樟芝菌絲體液態(tài)發(fā)酵，同時(shí)顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物中三萜的產(chǎn)量。但尚無(wú)有關(guān)灰樹(shù)花生物磁效應(yīng)的相關(guān)研究，本項(xiàng)目采用搖瓶試驗(yàn)的方式，對(duì)灰樹(shù)花菌株液態(tài)發(fā)酵進(jìn)行研究，探索磁場(chǎng)(低頻交變磁場(chǎng))作用下，磁感應(yīng)強(qiáng)度、初次磁處理介入時(shí)間以及每天作用時(shí)長(zhǎng)等條件因素對(duì)灰樹(shù)花液體發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量、營(yíng)養(yǎng)成分等的影響，旨在提高液體發(fā)酵生產(chǎn)灰樹(shù)花的效率，以期為后一步灰樹(shù)花液體發(fā)酵工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)提供一種普遍適用的提高產(chǎn)率的新思路。

1 材料與方法

1.1儀器設(shè)備

本試驗(yàn)使用的磁場(chǎng)搖床設(shè)備圖如圖 1 所示，其中1為220V交流電源；2為T(mén)DGC2-3k 3000VA單相接觸調(diào)壓器(磁感應(yīng)強(qiáng)度通過(guò)變壓器調(diào)節(jié))；3為繞線(xiàn)圈搖床孔(6個(gè)搖床孔大小一致，所繞線(xiàn)圈參數(shù)一致，故各磁場(chǎng)發(fā)生器中的磁感應(yīng)強(qiáng)度全部相等)；4為試驗(yàn)用250 mL三角燒瓶；5為搖床；6為搖床電源開(kāi)關(guān)；7為轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)按鈕；8為轉(zhuǎn)速顯示屏(轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r/min)。磁感應(yīng)強(qiáng)度通過(guò)高斯計(jì)測(cè)定。試驗(yàn)組三角瓶被放置在磁場(chǎng)發(fā)生器中，溫度通過(guò)空調(diào)控制在28 ℃左右。

圖1 磁場(chǎng)搖床試驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of magnetic shaking incubators

JZ5002型電子天平，上海天平儀器廠；G154DWS型立式滅菌鍋，南京庚辰科學(xué)儀器有限公司；VS-1300L-U型潔凈工作臺(tái)，蘇凈基團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PSX-280H型恒溫培養(yǎng)箱，寧波萊福科技有限公司；HYL-C型搖床，太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LD5-2A型離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；PHS-25酸度計(jì)，上海理達(dá)儀器廠；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；Nicolet IS50傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)尼高力儀器公司。

1.2菌株

灰樹(shù)花(G.frondosa)菌株由江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院劉偉民教授惠贈(zèng)。保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，菌種保藏編號(hào)M2011113。

1.3主要試劑

葡萄糖、MgSO4、KH2PO4、NaOH、氯仿、正丁醇、濃HCl、濃H2SO4、無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚等：分析純；大豆蛋白胨、瓊脂粉等：生物試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；馬鈴薯浸出粉：生物試劑，杭州百思生物技術(shù)有限公司。

1.4培養(yǎng)基的配置

1.4.1 斜面培養(yǎng)基

馬鈴薯浸出粉6 g/L、葡萄糖20 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41.50 g/L、大豆蛋白胨5 g/L和瓊脂粉20 g/L。分裝至20 mm×200 mm的具塞試管中，每支裝入10 mL。用2層報(bào)紙封口，將封裝好的試管置于滅菌鍋中，121℃滅菌20 min。

1.4.2 種子液培養(yǎng)基

馬鈴薯浸出粉6 g/L、葡萄糖20 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41.50 g/L和大豆蛋白胨5 g/L。分裝至250 mL的三角瓶中，每瓶裝入100 mL。用8層紗布和2層報(bào)紙封口，將封裝好的三角瓶置于滅菌鍋中，121 ℃滅菌20 min。

1.4.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基

配制方法同1.4.2 種子液培養(yǎng)基液體種子培養(yǎng)基配制。

1.5培養(yǎng)方法

1.5.1 菌種保藏方法

將灰樹(shù)花(G.frondosa)接種于PDA斜面，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，置于4 ℃冰箱中備用。每3個(gè)月轉(zhuǎn)接1次。

1.5.2 種子液培養(yǎng)方法

從活化后的斜面上，用接種鏟切取面積0.5 cm×0.5 cm的菌體，轉(zhuǎn)接入裝有100 mL種子液培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)5 d。

1.5.3 對(duì)照組發(fā)酵的搖瓶培養(yǎng)

以10%體積分?jǐn)?shù)的接種量，將灰樹(shù)花種子液接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵對(duì)照組放置于恒溫培養(yǎng)搖床上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度28 ℃、振蕩速度150 r/min、發(fā)酵5 d。每個(gè)處理水平設(shè)3個(gè)生物重復(fù)。

1.5.4 磁場(chǎng)輔助發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗(yàn)

以10%體積分?jǐn)?shù)的接種量，將灰樹(shù)花種子液接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵試驗(yàn)組放置于恒溫培養(yǎng)搖床上培養(yǎng)，每天于相同時(shí)間段取出轉(zhuǎn)移至自制磁場(chǎng)搖床中，開(kāi)啟磁場(chǎng)搖床，對(duì)發(fā)酵液施加一定時(shí)長(zhǎng)、一定強(qiáng)度的弱磁場(chǎng)，在磁輔助處理結(jié)束后迅速將樣品返回至恒溫培養(yǎng)搖床上繼續(xù)培養(yǎng)。計(jì)劃通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化的參數(shù)為：磁感應(yīng)強(qiáng)度、接種后初次磁處理介入時(shí)間、磁處理時(shí)長(zhǎng)。其他發(fā)酵條件同發(fā)酵對(duì)照組，每個(gè)處理水平設(shè)3個(gè)生物重復(fù)。

1.6灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體干重的測(cè)定

將發(fā)酵所得的菌絲體離心(5 000 r/min，10 min)，用蒸餾水沖洗除去表面所黏附的培養(yǎng)液，放入鼓風(fēng)干燥箱中，50 ℃條件下干燥至恒質(zhì)量，電子天平稱(chēng)量即得菌絲干質(zhì)量。菌絲體干重提高率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式(1)中：L為菌絲體干重提高率；m為各磁場(chǎng)輔助發(fā)酵條件處理后的灰樹(shù)花菌絲干質(zhì)量；n為對(duì)照組灰樹(shù)花菌絲干質(zhì)量。

1.7灰樹(shù)花發(fā)酵液pH的測(cè)定

使用pH計(jì)對(duì)發(fā)酵所得的菌液直接進(jìn)行測(cè)定。

1.8掃描電鏡觀察菌絲體

對(duì)照組和試驗(yàn)組同時(shí)取時(shí)間點(diǎn)為第4次磁處理結(jié)束后的濕菌絲體用，0.1 mol/L PBS緩沖液清洗3次，以除凈菌體上的培養(yǎng)基成分。加入2.5%戊二醛固定液，4 ℃冰箱中固定2 h以上。再用0.1 mol/L PBS清洗3次，15 min/次。依次采用50%、70%、80%、90%、95%、100%體積分?jǐn)?shù)的乙醇梯度脫水各1次，15 min/次。再用加入飽和Na2SO4的無(wú)水乙醇脫水15 min。CO2臨界點(diǎn)干燥。將干燥后的樣品固定在干凈的鋁箔片上，置于樣品倉(cāng)中進(jìn)行噴金處理。樣品取出后，置于掃描電鏡觀察室中進(jìn)行觀察。

1.9灰樹(shù)花菌絲體水溶性粗多糖紅外光譜的測(cè)定

根據(jù)1.6菌絲體生物量測(cè)定結(jié)果確定磁場(chǎng)輔助發(fā)酵條件下?lián)u瓶培養(yǎng)的最優(yōu)條件。

將最優(yōu)磁處理輔助條件下發(fā)酵生產(chǎn)出的菌絲體和對(duì)照組菌絲體分別冷凍干燥后研磨粉碎，與蒸餾水按1∶25(v/v)料液比混合，80 ℃水浴6 h。使用布氏漏斗過(guò)濾取上清液，減壓濃縮至原體積的1/10。加入Sevage試劑[V(濃縮上清液)∶V(氯仿)∶V(正丁醇)=25∶4∶1)，充分振搖20 min后，靜置萃取，取上層溶液，重復(fù)脫蛋白，直到蛋白層消失，即得除去蛋白的粗多糖溶液。將4倍體積的無(wú)水乙醇緩慢加入多糖溶液中，于4 ℃冰箱中靜置過(guò)夜，在3 000 r/min 下離心20 min，收集沉淀。沉淀冷凍干燥至恒重，得最優(yōu)發(fā)酵條件下生產(chǎn)出的菌絲體和對(duì)照組菌絲體水溶性粗多糖。

將提取后的粗多糖粉末放入樣品槽，按照儀器操作流程對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試。

對(duì)比對(duì)照組常規(guī)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的灰樹(shù)花粗多糖的紅外譜圖和最優(yōu)磁處理輔助條件下發(fā)酵培養(yǎng)的灰樹(shù)花粗多糖的紅外譜圖，根據(jù)紅外光譜特征吸收頻率和紅外特性吸收譜帶的出現(xiàn)與否，研究2種粗多糖樣品的成分是否發(fā)生變化。

1.10灰樹(shù)花菌絲體一般性化學(xué)成分的測(cè)定

根據(jù)1.6小節(jié)菌絲體生物量測(cè)定結(jié)果確定磁場(chǎng)輔助發(fā)酵條件下?lián)u瓶培養(yǎng)的最優(yōu)條件。分別對(duì)最優(yōu)磁處理輔助條件下發(fā)酵和對(duì)照組發(fā)酵生產(chǎn)的菌絲體進(jìn)行化學(xué)成分測(cè)定試驗(yàn)。

將待測(cè)菌絲體凍干后，粉碎過(guò)60目篩，水分以?xún)龈傻淖訉?shí)體為樣品，總糖、粗蛋白、粗脂肪按干物質(zhì)計(jì)算，粗纖維檢測(cè)樣品未粉碎過(guò)篩。

各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定方法如下：

水分測(cè)定：按照 GB 5009.3—2016“食品中水分的測(cè)定”進(jìn)行測(cè)定，選用直接干燥法測(cè)定；

總糖測(cè)定：按照按照 GB/T 15672—2009“食用菌中總糖含量的測(cè)定”進(jìn)行測(cè)定；

粗蛋白測(cè)定：按照 GB 5009.5—2016“食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定” 進(jìn)行測(cè)定，選用凱氏定氮法測(cè)定；

粗脂肪測(cè)定：按照 GB 5009.6—2016“食品中脂肪的測(cè)定”進(jìn)行測(cè)定，選用索氏抽提法測(cè)定；

粗纖維測(cè)定：按照 GB/T 5009.10—2003“植物類(lèi)食品中粗纖維的測(cè)定”進(jìn)行測(cè)定。

1.11數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行處理。圖和表中結(jié)果為3個(gè)生物重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用one way ANOVA 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析，P<0.05表示顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1磁感應(yīng)強(qiáng)度對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體干重提高率的影響

通過(guò)先期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，預(yù)設(shè)磁處理初次介入時(shí)間為接種后1 h，每天于同一時(shí)間段磁場(chǎng)處理時(shí)長(zhǎng)設(shè)為3 h，磁感應(yīng)強(qiáng)度分別調(diào)至：15、25、35、45、55 Gs。磁感應(yīng)強(qiáng)度對(duì)菌絲體干重提高率的影響如圖2所示。由圖2可知，磁感應(yīng)強(qiáng)度為35 Gs時(shí)，菌絲體干重提高率最高。因此后續(xù)試驗(yàn)選擇35 Gs為最佳磁處理強(qiáng)度。

圖2 磁感應(yīng)強(qiáng)度對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體干重提高率的影響Fig.2 Effect of magnetic field induction on dry weight of G. frondosa

2.2接種后初次磁處理介入時(shí)間對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體干重提高率的影響

將每天同一時(shí)間段磁場(chǎng)處理時(shí)長(zhǎng)設(shè)為3 h，磁感應(yīng)強(qiáng)度調(diào)至35 Gs，依次在接種后1、7、13、18、23 h開(kāi)始進(jìn)行初次磁處理。初次磁處理介入時(shí)間對(duì)菌絲體干重提高率的影響如圖3所示。由圖3可知，在接種后1 h開(kāi)始進(jìn)行初次磁場(chǎng)處理，菌絲體干重提高率最高。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇初次磁處理介入時(shí)間為1 h。

圖3 磁場(chǎng)處理開(kāi)始時(shí)間對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體干重提高率的影響Fig.3 Effect of magnetic treatment start time on dry weight of G. frondosa

2.3磁處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體干重提高率的影響

將初次磁處理介入時(shí)間定為1 h，磁感應(yīng)強(qiáng)度調(diào)至35 Gs，磁處理時(shí)長(zhǎng)分別設(shè)定為：1、2、3、4、5、6、7 h。磁處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)菌絲體干重提高率的影響如圖4所示。由圖4可知，每天磁處理時(shí)長(zhǎng)3 h時(shí)菌絲體干重提高率最高。

圖4 磁處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體干重提高率的影響Fig.4 Effect of magnetic treatment exposure time on dry weight of G. frondosa

經(jīng)過(guò)單因素逐級(jí)優(yōu)化，獲得灰樹(shù)花磁場(chǎng)輔助液體發(fā)酵最佳的條件為初次磁處理介入時(shí)間為接種后1 h、磁感應(yīng)強(qiáng)度35 Gs、每天于同一時(shí)間段磁處理時(shí)長(zhǎng)3 h。在該條件下，與對(duì)照組相比，菌絲體干重提高率達(dá)到11.43%。

2.4低強(qiáng)磁場(chǎng)輔助發(fā)酵“生物學(xué)窗效應(yīng)”的初步研究

磁處理時(shí)長(zhǎng)反映了對(duì)發(fā)酵液施加磁作用劑量的大小，從圖4可以看出，在磁處理時(shí)長(zhǎng)1～7 h之間出現(xiàn)了2個(gè)峰值，這個(gè)規(guī)律應(yīng)該是低強(qiáng)交變磁場(chǎng)對(duì)微生物活性影響表現(xiàn)出的“生物學(xué)窗效應(yīng)”。電磁波的生物學(xué)窗效應(yīng)是指只有某些個(gè)離散的、電磁場(chǎng)參數(shù)(例如頻率、場(chǎng)強(qiáng)、作用時(shí)間等)區(qū)間極窄的電磁波才能產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)[15]。作者在脈沖強(qiáng)磁殺菌時(shí)多次發(fā)現(xiàn)了生物學(xué)窗效應(yīng)，并通過(guò)鈣離子的跨膜行為等方法進(jìn)行了窗效應(yīng)發(fā)生機(jī)制的探討[16-17]。

微生物發(fā)酵過(guò)程中pH值與微生物的生長(zhǎng)狀況有密切的關(guān)系，因此可以通過(guò)測(cè)定不同磁處理時(shí)長(zhǎng)下發(fā)酵液pH值的變化，初步探索生物學(xué)窗效應(yīng)發(fā)生的原因。圖5是不同磁處理時(shí)長(zhǎng)下5天發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液的最終pH值。從圖5可以看出，發(fā)酵液pH值和菌絲體干重提高率的變化趨勢(shì)基本一致，也大致在相同的位置出現(xiàn)2個(gè)峰值，初步說(shuō)明窗效應(yīng)的發(fā)生與發(fā)酵液pH值的變化有關(guān)(對(duì)照組pH 3.82)。當(dāng)然，對(duì)于低強(qiáng)磁場(chǎng)促進(jìn)微生物發(fā)酵是否有窗效應(yīng)發(fā)生及其發(fā)生的機(jī)理，尚需進(jìn)行更深入的研究。

圖5 磁場(chǎng)處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)發(fā)酵液pH的影響Fig.5 Effect of magnetic treatment exposure time on the pH

2.5掃描電鏡觀察結(jié)果

通過(guò)掃描電鏡對(duì)樣品表面的超微形貌進(jìn)行觀察，從圖6可以看出，普通液態(tài)發(fā)酵進(jìn)行到第76 h(第4次處理結(jié)束)時(shí)獲得的灰樹(shù)花菌絲體(圖6 A)表面光滑飽滿(mǎn)，菌絲直徑一致且彎折較少，結(jié)構(gòu)致密，菌絲體上開(kāi)始出現(xiàn)小分枝。而磁場(chǎng)輔助發(fā)酵獲得的菌絲體(圖6 B)發(fā)酵進(jìn)行到第76 h時(shí)，菌絲體表面粗糙、坑洼、部分細(xì)胞壁被破壞，菌絲直徑明顯不一、旋轉(zhuǎn)彎折嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)較對(duì)照組疏松，菌絲體上出現(xiàn)大量小的新分枝，部分分支點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)多個(gè)小分枝。在磁處理后菌絲體分枝明顯變多，菌絲體出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，生長(zhǎng)速度加快，從而達(dá)到促進(jìn)發(fā)酵的作用，并且磁處理后的菌絲體更為松散，松散的結(jié)構(gòu)有助于發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物等物質(zhì)的傳遞運(yùn)輸，也可能導(dǎo)致試驗(yàn)組生長(zhǎng)速率相對(duì)更快。

圖6 普通發(fā)酵(A)與磁場(chǎng)輔助發(fā)酵(B)所得灰樹(shù)花菌絲體Fig.6 Mycelia from traditional (A) and magnetic field (B) fermentation of G. frondosa

2.6灰樹(shù)花菌絲體水溶性粗多糖紅外光譜測(cè)定結(jié)果

灰樹(shù)花多糖(Grifolafrondosapolysaccharide，GFP)是灰樹(shù)花中極為重要的生物活性物質(zhì)。圖7是對(duì)照組和最優(yōu)條件下試驗(yàn)組菌絲體水溶性粗多糖的紅外圖譜。由于多糖結(jié)構(gòu)的相似性，其紅外光譜具有一些相同的特征吸收峰。

圖7 對(duì)照組與試驗(yàn)組菌絲體多糖的紅外圖譜Fig.7 Infrared spectrum of mycelia polysaccharide from control group and experimental group of G. frondosa

2.7灰樹(shù)花菌絲體一般性化學(xué)成分分析

常規(guī)發(fā)酵對(duì)照組和最優(yōu)磁場(chǎng)輔助發(fā)酵試驗(yàn)組菌絲體各一般性化學(xué)成分分析結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組纖維、總糖含量較對(duì)照組提高，水分、粗蛋白含量較對(duì)照組降低，粗脂肪含量無(wú)明顯變化。其中粗纖維含量的極顯著增高可能是由磁場(chǎng)輔助處理對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用后，細(xì)胞的應(yīng)激性反應(yīng)造成。粗蛋白含量的降低可能是由于磁場(chǎng)輔助處理改變細(xì)胞膜通透性后，菌絲體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分向發(fā)酵液中轉(zhuǎn)移造成(由于發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定會(huì)受到培養(yǎng)基成分的影響，本研究只側(cè)重研究菌絲體營(yíng)養(yǎng)成分)。

表1 對(duì)照組與試驗(yàn)組菌絲體一般性成分分析

注：同一行不同小寫(xiě)字母表示兩個(gè)數(shù)據(jù)存在顯著差異(p<0.05)，同一行不同大寫(xiě)字母表示2個(gè)數(shù)據(jù)存在極顯著差異(p<0.01)

3 結(jié)論

(1)灰樹(shù)花磁場(chǎng)輔助液體發(fā)酵最佳的條件為：磁感應(yīng)強(qiáng)度為35 Gs、初次磁處理介入時(shí)間為接種后1 h、每天同一時(shí)間段磁輔助處理時(shí)長(zhǎng)為3 h。在該條件下，菌絲體干重提高率達(dá)到11.43%。

(2)在磁場(chǎng)處理時(shí)長(zhǎng)為3 h和5 h時(shí)，出現(xiàn)了磁場(chǎng)促進(jìn)灰樹(shù)花生長(zhǎng)的“生物學(xué)窗效應(yīng)”，借助發(fā)酵液pH值的變化對(duì)窗效應(yīng)的發(fā)生原因進(jìn)行了初步探討。

(3)通過(guò)掃描電鏡觀察，低強(qiáng)交變磁場(chǎng)造成灰樹(shù)花菌絲體表面皺縮、菌絲旋轉(zhuǎn)，部分菌絲體出現(xiàn)膨大和變細(xì)，同時(shí)試驗(yàn)組菌絲體較對(duì)照組產(chǎn)生更多的分枝，且菌絲體結(jié)構(gòu)更為松散，這可能是其能促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)的原因。

(4)通過(guò)對(duì)對(duì)照組及試驗(yàn)組水溶性粗多糖的紅外光譜測(cè)定分析可以判斷，2種發(fā)酵方法獲得的菌絲體多糖相同或?yàn)橄嗨仆滴铩?/p>

(5)通過(guò)一般性化學(xué)成分分析，雖然試驗(yàn)組菌絲體中的部分營(yíng)養(yǎng)成分含量較對(duì)照組有所降低，但由于交變磁場(chǎng)輔助處理對(duì)菌絲體生物量的提高，營(yíng)養(yǎng)成分總量仍較對(duì)照組均有所提高。同時(shí)經(jīng)過(guò)測(cè)算，最優(yōu)條件下每次搖瓶試驗(yàn)總用電量約0.3 kW。由此可見(jiàn)，清潔、安全的磁輔助發(fā)酵技術(shù)能耗極低，具有較強(qiáng)的實(shí)用意義。

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StimulationofGriflolafrondosaliquidfermentationthroughlow-intensityalternatingmagneticfieldanditspreliminarystudyofbiologicalwindoweffects

LI Xin-yi, YE Xiao-fei*, MA Hai-le, LIU Wei-min, SUN Lin, KONG Na

(School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Jiangsu Provincial Key Laboratory for Food Physical Processing, Zhejiang 212013, China)

The stimulation ofGriflolafrondosafermentation through alternating magnetic field was studied by using a self designed generator with adjustable magnetic field intensity, magnetic treatment start time and exposure time. The reason for occurrence of biological window effects was preliminarily discussed by virtue of the pH of fermentation liquor. Scanning electronic microscope (SEM), infrared spectroscopy (IR), and general chemical composition analysis were used to compare and analyze the differences between normal liquid state fermentation and magnetic field liquid state fermentation. Results showed that when the intensity of the magnetic field was 35 Gs, magnetic treatment start time was 1 h after inoculation and exposure time was 3 h, the stimulation forGriflolafrondosaliquid fermentation was the strongest, and the dry weight of theGriflolafrondosaincreased 11.43% and all the nutrients were increased. When the exposure time of the magnetic field was 3 h and 5 h, biological window effects of low-intensity alternating magnetic field onG.frondosawas found.

Griflolafrondosa；liquid fermentation；alternating magnetic field；window effects

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014492

碩士研究生(葉曉非教授為通訊作者,E-mail:yexx0023@yahoo.com)。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAD36B05)

2017-04-10，改回日期：2017-05-03