發芽糙米多糖雙水相萃取工藝優化及其抗氧化活性

劉曉飛

王 鑫2

孟慶虹1

張 宇2

龔麗麗2

馬永強2

盧淑雯1

(1. 黑龍江省農業科學院博士后科研工作站，黑龍江 哈爾濱 150086；2. 哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076)

發芽糙米多糖雙水相萃取工藝優化及其抗氧化活性

劉曉飛1,2

王 鑫2

孟慶虹1

張 宇2

龔麗麗2

馬永強2

盧淑雯1

(1. 黑龍江省農業科學院博士后科研工作站，黑龍江 哈爾濱 150086；2. 哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076)

以發芽糙米為原料，采用超聲波輔助雙水相法萃取對發芽糙米多糖的分配系數進行研究，多糖得率作為考察目標，通過正交試驗確定超聲波輔助雙水相萃取發芽糙米多糖的最佳提取工藝條件。結果表明：發芽糙米多糖最優提取工藝為選用PEG6000、PEG6000添加量15.7%、硫酸銨添加量14.8%、萃取時間40 min，該條件下多糖得率為81.07%。并采用DPPH法、鄰苯三酚自氧化法和鄰二氮菲法檢測提取的多糖抗氧化活性。研究發現發芽糙米多糖對DPPH自由基、超氧陰離子自由基以及羥基自由基均有較強的抗氧化作用。

發芽糙米；多糖；超聲波；雙水相萃取；抗氧化性

糙米是稻谷在加工過程中保留果皮、種皮、糊粉層和胚，經礱谷僅脫去穎殼后的谷粒。糙米是一種全糧食品，是功能食品最好的來源，并且普遍具有多項保健功能[1]。糙米發芽時大量酶被激活和釋放，生成γ-氨基丁酸等有益的生物活性成分[2-3]，使發芽糙米具有抗氧化，降低血脂、降血壓、降血糖等作用，已被作為功能性食品配料和營養強化劑而廣泛應用于食品、醫藥等行業中[4]。

雙水相萃取是一種新型的生物分離技術，具有分離條件溫和、傳質速度快、成相時間短、能耗低、適合大規模操作、生物親和性好等優點[5-6]，已經廣泛應用于食品化工、細胞生物學、生物工程、植物有效成分的分離等[7]。孫亞莉等[8]利用雙水相體系萃取分離葡萄籽多糖，分別考察了PEG質量分數、硫酸銨質量分數和萃取溫度3個因素對葡萄籽多糖的影響，最佳萃取率可達55.1%。Xing Jianmin等[9]采用雙水相萃取超濾膜結合的方法提取蘆薈多糖，結果顯示蘆薈多糖純度高，富含甘露糖單糖，且葡萄糖殘留物較少。劉琳等[10]利用乙醇/K2CO3雙水相實現一步操作分離提取樺褐孔菌發酵液中的三萜化合物和多糖，此方法分離效果好，有利于產品的后續純化。

目前對發芽糙米的研究主要集中在發芽工藝[11-13]、γ-氨基丁酸富集[14-15]、糙米發芽后營養物質的變化情況[16-17]及以發芽糙米為原料的各種食品制作上[18-19]，目前中國尚無發芽糙米多糖提取的研究，因此，本試驗以發芽糙米為原料，采用聚乙二醇(PEG)/硫酸銨雙水相體系對萃取發芽糙米多糖的提取條件進行優化，并對多糖抗氧化性進行研究，以期為發芽糙米多糖的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

稻谷：龍粳，黑龍江省農業科學院。

1.2 試驗儀器

超聲波細胞粉碎儀：JY92-ⅡD型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外可見分光光度計：SP-752PC型，上海光譜儀器有限公司；

臺式高速離心機：TGL-16G型，湖南星科科學儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HHS-12型，上海東星建材實驗設備有限公司；

電子分析天平：BS224S型，賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 糙米發芽 龔谷機去除稻谷外殼得到糙米，去除不完整的米粒和雜質，將糙米放入去離子水中浸泡2 h，取出均勻平鋪托盤上，在恒溫恒濕箱中進行發芽(溫度30 ℃、濕度98%、發芽24 h)[20]。80 ℃恒溫干燥箱中滅酶30 min后，55 ℃恒溫烘干，粉碎過篩(80目)備用。

1.3.2 總糖含量測定 采用苯酚硫酸法[19]。

1.3.3 雙水相萃取體系的制備 取發芽糙米粉10.0 g，加入蒸餾水，料液比1∶10 (g/mL)，超聲功率500 W超聲25 min[22]，超聲溫度50 ℃，冷卻至室溫，3 000 r/min 離心20 min，取上清液，蒸餾水定容至1 000 mL，待用。單因素試驗時每次取樣20 mL，稱取一定質量的PEG，溶解后稱取不同質量的硫酸銨，振蕩混合，靜置40 min。分相后記錄上下相體積，620 nm波長下檢測，計算出多糖在不同雙水相體系中的含量[21-22]。

(1)

(2)

(3)

式中：

K——發芽糙米多糖在PEG/硫酸銨兩相體系中的分配系數；

R——上下相體積之比；

Y——多糖在上相中的得率，%；

Ca——上相中多糖質量濃度，mg/mL；

Cb——下相中多糖質量濃度，mg/mL；

Va——上相體積，mL；

Vb——下相體積，mL。

1.3.4 發芽糙米多糖單因素優化

(1) PEG分子質量：發芽糙米多糖提取液20 mL，硫酸銨添加量5.0 g，分別加入4.0 g PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000，形成雙水相體系，于分液漏斗中萃取40 min。分相完全后，記錄上下相體積，研究發芽糙米中多糖的得率。

(2) PEG添加量：發芽糙米多糖提取液20 mL，硫酸銨添加量5.0 g，PEG6000添加量分別為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 g，形成雙水相體系，于分液漏斗中萃取40 min。分相完全后，記錄上下相體積，研究發芽糙米中多糖的得率。

(3) 硫酸銨添加量：發芽糙米多糖提取液20 mL，PEG6000添加量4.0 g，硫酸銨添加量分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 g，形成雙水相體系，于分液漏斗中萃取40 min。分相完全后，記錄上下相體積，研究發芽糙米中多糖的得率。

(4) 萃取時間：發芽糙米多糖提取液20 mL，硫酸銨添加量5.0 g，PEG6000添加量4.0 g，形成雙水相體系，于分液漏斗中萃取20，30，40，50，60 min。分相完全后，記錄上下相體積，研究發芽糙米中多糖的得率。

1.3.5 發芽糙米多糖抗氧化性的測定

(1) DPPH·清除率的測定：參照文獻[23]，按式(4)計算DPPH·清除率D。

(4)

式中：

D——DPPH·清除率，%；

A0——空白管吸光值；

Ai——多糖樣品吸光值；

Aj——多糖樣品對照組吸光值。

(5)

式中：

ΔA0——空白管吸光值；

ΔA——多糖樣品吸光值。

(3) 羥基自由基(·OH)清除率的測定：參照文獻[25]，按式(6)計算·OH清除率E。

(6)

式中：

E——·OH清除率，%；

A樣——多糖樣品吸光值；

A未——未損傷管的吸光值；

A損——損傷管的吸光值。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線繪制

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖回歸方程：y=0.012x-0.003 5，R2=0.989 6，曲線相關性較好。

2.2 雙水相萃取發芽糙米的分配平衡單因素試驗

2.2.1 PEG分子量對發芽糙米多糖得率的影響 發芽糙米中多糖在不同雙水相體系中上下相溶液中的含量及多糖得率的結果見圖2～4。

圖2 分配系數K與PEG分子量的關系

圖3 上下相體積比與PEG分子量的關系

圖4 多糖得率與PEG分子量的關系

由圖2～4可知，在硫酸銨添加量一定的情況下，PEG相對分子質量的變化，使得上下相體積比R有微小波動，但總體變化不大。而多糖分配系數K和多糖得率受PEG分子量影響較大，隨著PEG相對分子質量的增大，雙水相黏度增大，成相物質分子的空間阻礙作用增加[8]，導致K值呈現先增后減的趨勢，在PEG6000處有最大值，因此，PEG6000最有利于發芽糙米多糖在上相富集，得率為75.27%。

2.2.2 PEG添加量對發芽糙米多糖得率的影響 發芽糙米中多糖在不同雙水相體系中上下相溶液中的含量及得率見圖5～7。

由圖5～7可知，隨著PEG添加量的增加，上下相體積比R變化幅度不大，而分配系數K則呈現明顯的先增后減的趨勢，受此影響，多糖得率表現出同樣的走勢，并在PEG添加量達到15.7%時出現最大值(65.03%)，繼續增加PEG添加量會導致溶液的黏度很大，給生產過程帶來不利影響，并且多糖得率開始降低，與馬新輝等[28]的試驗結果相近。

圖5 分配系數K與PEG添加量的關系

圖6 上下相體積比與PEG添加量的關系

圖7 多糖得率與PEG添加量的關系

2.2.3 硫酸銨添加量對發芽糙米多糖得率的影響 發芽糙米多糖在不同雙水相體系中上下相溶液中的含量及得率見圖8～10。

由圖8～10可知，硫酸銨的添加量對上下相體積比和分配系數有較大影響，2組數據都隨著硫酸銨添加量的增加呈現先增后減的趨勢；添加量為14.8%時，分配系數有最大，而上下相體積比最大值則出現在添加量為20.6%處。由此，綜合2組數據所得多糖得率總體變化不大，在硫酸銨添加量為14.8%處有最大值(73.25%)。考慮到雙水相體系中硫酸銨添加量過大時，會造成硫酸銨不溶解，影響PEG的回收[27]，故選擇硫酸銨添加量為14.8%。

2.2.4 萃取時間對發芽糙米多糖得率的影響 發芽糙米中多糖在不同雙水相體系中上下相溶液中的含量及得率見圖11～13。

由圖11～13可知，時間因素對于整個雙水相萃取過程影響不大，上下相體積比和分配系數都隨萃取時間的延長逐漸增大，但變化幅度較小，當時間增加至40 min時，曲線趨于平緩，不再增加，甚至還有較小程度的降低。原因可能是超聲波對多糖得率的影響起初起到促進作用，超過一定時間后，超聲波會導致多糖的部分降解。所以確定萃取時間為40 min最適宜。

圖8 分配系數K與硫酸銨添加量的關系

圖10 多糖得率與硫酸銨添加量的關系

圖11 分配系數K與萃取時間的關系

圖12 上下相體積比與萃取時間的關系

圖13 多糖得率與萃取時間的關系

2.3 超聲波輔助雙水相萃取多糖的正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，以多糖得率為評價指標，對PEG分子量、PEG質量分數、硫酸銨質量分數、萃取時間進行正交試驗，試驗設計與結果見表1、2。

由表2可知，各因素對多糖得率的影響大小順序為：PEG分子量>硫酸銨質量分數>PEG質量分數>萃取時間。正交試驗最優組合A2B3C2D2，即選用PEG6000、PEG6000添加量15.7%、硫酸銨添加量14.8%、萃取時間40 min，在此條件下進行驗證實驗，重復3次，取其平均值，多糖得率為81.07%。

2.4 發芽糙米多糖抗氧化活性

2.4.1 DPPH法測定發芽糙米多糖抗氧化性 發芽糙米多糖濃度與DPPH·的清除關系見圖14。

表1 正交設計試驗

表2 多糖提取條件優化正交試驗結果與分析

圖14 多糖濃度與DPPH·清除的關系

Figure 14 Scavenging effect of polysaccharide from germinated brown rice by DPPH· method

由圖14可知，DPPH·的清除率隨著發芽糙米多糖濃度的增加而增大，呈現劑量依賴性，當葡萄糖濃度為0.6 mg/mL時，DPPH·清除率達到81.85%。說明發芽糙米多糖具有良好的DPPH·清除活性。

由圖15可知，多糖濃度<0.3 mg/mL時，對超氧陰離子自由基的清除能力基本保持在55%左右，之后繼續增大多糖濃度，其清除超氧陰離子自由基的能力逐漸增強，當濃度達到0.6 mg/mL時，超氧陰離子自由基清除率達到68.77%，說明發芽糙米多糖對超氧陰離子自由基具有較好清除作用。

圖15 多糖濃度與超氧陰離子自由基清除的關系

2.4.3 鄰二氮菲法測定發芽糙米多糖抗氧化性 發芽糙米多糖濃度與羥基自由基(·OH)的清除關系見圖16。

由圖16可知，對羥基自由基的清除能力隨多糖濃度升高逐漸增強，當發芽糙米多糖濃度達到0.5 mg/mL時，趨于穩定，羥基自由基清除率約為53%，抗氧化性最強。與黃越等[29]的研究結果相似。

圖16 多糖濃度與羥基自由基清除的關系

Figure 16 Scavenging effect of polysaccharide from germinated brown rice by ·OH method

3 結論

經對影響多糖得率的因素進行單因素試驗，并通過正交試驗確定超聲波輔助雙水相法萃取發芽糙米多糖的最佳工藝條件為：選用PEG6000、PEG6000添加量15.7%、硫酸銨添加量14.8%、萃取時間40 min，此條件下多糖得率為81.07%。萃取過程簡單可行，可以進一步優化雙水相的組分以期得到收率更高的發芽糙米多糖。

發芽糙米多糖具有較強的抗氧化作用，對DPPH自由基、超氧陰離子以及羥基自由基清除率分別達到81.85%，68.77%，53.00%。發芽糙米多糖可以作為一種良好的抗氧化劑進行開發利用。

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Extraction of polysaccharide from germinated brown rice by aqueous two-phase system and research of its antioxidant activity

LIUXiao-fei1,2

WANGXin1

MENGQing-hong1

ZHANGYu2

GONGLi-li2

MAYong-qiang2

LUShu-wen1

(1.HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciencesPostdoctoralProgramme,Harbin,Heilongjiang150086,China; 2.KeyLaboratoryforFoodScienceandEngineering,HarbinUniversityofCommerce,Harbin,Heilongjiang150076,China)

The polysaccharide was extracted by the ultrasonic-assisted aqueous two-phase technology from germinated brown rice. The phase separation ability of different in PEG/(NH4)2SO4system was studied according to the polysaccharide yield. The yield of polysaccharide substance of germinated brown rice was determined by orthogonal experiment. The optimum process conditions were determined. Results were showed as follows: the mass fraction of PEG6000 was 15.7%, the mass fraction of ammonium sulfate was 14.8% and extraction time was 40 min. The yield of polysaccharide substance from germinated brown rice was 81.07% in the optimum conditions. Morever, the anti-oxidation of polysaccharide substance from germinated brown rice were studied by methods of DPPH, pyrogallol autoxidation and phenanthroline. The results showed that the polysaccharide of brown rice had stronger antioxidant effect to DPPH, ultra oxygen anion and hydroxyl radicals.

Germinated brown rice; polysaccharide; ultrasonic; two-phase extraction; antioxidant activity

黑龍江省博士后資助經費(編號：LBH-Z15200)；黑龍江省教育廳科學技術研究項目(編號：12541189)

劉曉飛，女，哈爾濱商業大學副教授，博士。

盧淑雯(1968—)，女，黑龍江省農業科學院研究員，博士。E-mail：shuwenl@sina.com

2017—05—16

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.033