海藻糖對草魚魚糜凍藏品質的影響

蘇 趙

胡 強

李樹紅

但 靜

李美良

林 靈

白稚子

楊 娟

柯勤勤

(四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

海藻糖對草魚魚糜凍藏品質的影響

蘇 趙

胡 強

李樹紅

但 靜

李美良

林 靈

白稚子

楊 娟

柯勤勤

(四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

為研究添加海藻糖對草魚冷凍魚糜蛋白質變性的抑制效果,首先檢測凍藏期(12周)內各組鹽溶性蛋白、總巰基、Ca2+-ATP酶活力、羰基含量的變化，發現6%添加量能最大程度地抑制蛋白質的變性，并于凍藏6個月后對基質構特性進行測定,其凝膠強度達3 026 g·mm，極顯著高于對照組(P<0.01)，掃描電鏡發現該組魚糜凝膠超微三維網狀結構更為緊實、致密、堅韌。綜上表明，6%的海藻糖能抑制草魚魚糜蛋白在冷凍過程中的變性，延緩魚糜凍藏品質的下降，其作為一種潛在的商業魚糜抗凍劑具有良好的應用前景。

草魚魚糜；海藻糖；抗凍劑；抗凍效果；魚糜品質

草魚(Ctenopharyngodonidella) 屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬，是中國主要的淡水養殖經濟魚種，年養殖產量達5.676 2×106t，位居全國第二位[1]，具有肉厚刺少、肉質白嫩、蛋白含量高、韌性好、出肉率高等優良特性，是加工魚糜及其制品的優良原料[2]。但2015年中國魚糜制品產量僅為1.454 2×106t，尚不及全國水產加工總量的10%。而將草魚精深加工制成魚糜能提高草魚的附加值，有利于充分利用中國的漁業資源，具有極為廣闊的市場前景[3]。

淡水魚類魚肉蛋白質多有穩定性較差的問題[4]，尤其容易在冷凍貯藏過程中發生變性，導致魚糜制品的彈性品質下降[5]59-60[6]23-26[7]。并且魚糜的工業化生產中采用機械采肉，通常原料為剖片后的整個魚片[8]，采肉后，魚糜中往往混有較多脂質成分，主要是由于魚類腹部肌肉組織中脂肪含量豐富[9]。而貯藏過程魚糜中脂肪氧化的次級產物(低級醛、酮類物質)也可進一步引起蛋白的氧化[5]20[6]29-30[10]，加劇蛋白貯藏期間的變性。因此，如何在魚糜冷藏過程中采取適宜的措施防止魚糜蛋白的冷凍變性，對提高淡水魚糜的凍藏品質具有重要的意義。

目前，工業上大多采用蔗糖、復合磷酸鹽為商業抗凍劑，雖對魚糜蛋白質有較好的抗凍效果[11]，但其“高熱、高甜”的特點不符合“低甜、低熱”的消費要求，過多的磷酸鹽攝入亦會導致機體鈣磷失衡，影響人體對鈣的吸收，可能導致骨質疏松癥等疾病[12]。海藻糖低甜、無毒，其甜度僅為蔗糖的45%，且WHO及FAO組織對其每日允許攝入量(ADI)不作限制[13]，中國在2014年已將海藻糖按照普通食品管理[14]。同時有研究發現，非還原性二糖海藻糖不僅具有穩定細胞膜和蛋白質的結構，增強細胞對高溫、干燥失水、高寒及高滲透壓等惡劣環境的抗性作用[15-16]，而且還能夠抑制脂肪酸的分解，穩定蛋白質，防止蛋白質冷凍變性和三甲胺等魚腥味物質生成[17]。研究表明，采用海藻糖溶液浸漬能防止冷凍羅非魚片的蛋白質變性[18]，采用海藻糖涂膜處理也對凍藏草魚塊的感官品質和質構特性均有所改善[19]。

截止目前，在以機械采肉制備的草魚魚糜蛋白冷凍變性方面的防治效果，尚無相關報道。因此，本試驗擬探討海藻糖對機械采肉加工的草魚魚糜凍藏品質的影響，為其以后在淡水魚糜中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

鮮活健康草魚：采購于四川省雅安市雨城區農貿市場，約1.5 kg/尾；

總蛋白(TP)測定試劑盒：南京建成生物研究所；

海藻糖：食品級，純度98%，日本株式會社林原；

其余試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

滾筒采肉機：CR-200型，山東省諸城市美川機械有限公司；

超級恒溫水浴鍋：HH-601型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

可見分光光度計：V-1200型，翱藝儀器(上海)有限公司；

酶標儀：Varioskan Flash-3001型，美國Thermo Scientific公司；

超聲破碎儀：Scientz-IID型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

物性測試儀：TA-XTPlus型，英國Stable Micro System公司；

超純水機：ULUP-IV-10T型，成都超純科技有限公司；

冰箱：BCD-579WE型，青島海爾股份有限公司；

電子天平：FA1204B型，上海越平儀器有限公司；

數顯pH計：PHS-3C型，上海佑科儀器有限公司；

掃描電鏡：JSM-7500F型，日本電子株式會社；

高速冷凍離心機：ST-16R型，美國Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 魚糜制備 工藝流程：

鮮活草魚→前處理→洗凈→機械采肉→漂洗→脫水→生鮮魚糜

工藝要點：

(1) 前處理：采用手工操作去頭、內臟、鱗片，將魚體沿主骨剖成兩半，并清洗魚體。

(2) 采肉：使用滾筒采肉機(孔徑3 mm)機械采肉，轉速：20 r/min。

(3) 漂洗：魚肉糜采用兩次清水一次食鹽水進行漂洗(魚肉糜與水質量比為1∶5，食鹽水濃度為0.15%，水溫0～4 ℃)。每次漂洗均攪拌10 min，靜置5 min，傾去漂洗液。

(4) 脫水：4 ℃條件下8 800×g離心15 min。

1.2.2 凍藏試驗

(1) 篩選適宜添加量：取制備的生鮮魚糜，分成6組，每組1 kg，按質量比添加海藻糖，依次為0，2%，4%，6%，8%，10%，混勻后各組于-20 ℃凍藏12周。分別于0，2，4，6，8，10，12周取樣測定各項指標，篩選適宜添加量。所有指標進行3次平行試驗。

(2) 適宜添加量組組織狀態測定：取制備的生鮮魚糜，分成2組，每組1 kg，一組添加6%海藻糖，另一組(空白組)不添加海藻糖，其他條件相同。2組-20 ℃凍藏24周。于24周凍藏結束后取樣，進行指標測定。所有指標進行3次平行試驗。

1.2.3 鹽溶性蛋白(SSP)含量的測定 稱取1 g魚糜樣品加入50 mmol/L KH2PO4—NaOH緩沖液(pH 7.0) 20 mL，離心(4 ℃，6 600×g，20 min)。取沉淀再加入0.6 mol/L KCl—50 mmol/L KH2PO4—NaOH緩沖液(pH 7.0) 20 mL，離心(4 ℃，6 600×g，20 min)。取上層離心液，使用含0.6 mol/L KCl—50 mmol/L KH2PO4—NaOH(pH 7.0)緩沖液定容至25 mL[20]。并采用考馬斯亮藍法測得鹽溶性蛋白(SSP)的濃度。鹽溶性蛋白含量按式(1)計算：

(1)

式中：

ssp——鹽溶性蛋白含量，mg/g；

c——考馬斯亮藍法測得蛋白濃度，mg/mL；

m——魚糜樣品質量，g。

1.2.4 魚糜肌動球蛋白的提取測定 參考文獻[21]的方法并稍作改動：稱取1.5 g魚糜樣品加入20 mL預冷的0.6 mol/L KCl(4 ℃，pH=7)，研磨，均質，離心(5 000×g，30 min，4 ℃)，取上層清液加入3倍體積去離子水再次離心(5 000×g，20 min，4 ℃)，取沉淀加入等體積的KCl(1.2 mol/L，pH=7)充分溶解，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。

1.2.5 蛋白總巰基(TSH)含量的測定 參考文獻[22]的方法。取1.2.4中提取并稀釋至4 mg/mL的肌動球蛋白溶液0.4 mL，加入0.2 mol/L Tris-HCl(含2% SDS，8 mol/L尿素，10 mmol/L EDTA，pH 6.8)緩沖液3.6 mL及0.2 mol/L的Tris-HCl(含0.1% DTNB，pH 8.0)緩沖液0.4 mL，將反應混合液于40 ℃水浴保溫25 min，在412 nm波長測定吸光度。分子吸光系數為13 600 L/(mol·cm)。蛋白質總巰基含量按式(2)計算：

(2)

式中：

TSH——蛋白質總巰基含量，μmol/g；

A412——412 nm處吸光度；

n——稀釋倍數；

ρ——蛋白質質量濃度，mg/g。

1.2.6 蛋白Ca2+-ATP酶(CA)活力的測定 參考文獻[22]。用0.1 mL 4 mg/mL的肌動球蛋白溶液與0.06 mL 0.5 mol/L Tris-馬來酸、0.79 mL 10 mm/L CaCl2、0.5 mL 20 mmol/L ATP溶液混合均勻，于25 ℃反應25 min后，加入0.5 mL 15% 三氯乙酸溶液終止反應，同時做空白對照，并提前加入三氯乙酸溶液。采用鉬酸銨法測定產生的無機磷含量[23]。Ca2+-ATP酶活力(CA)以在室溫(25 ℃)條件下每毫克肌動球蛋白在每分鐘內所生成的無機磷的微摩爾數表示，單位：μmol P/(mg Pro·min)。

1.2.7 蛋白羰基(CBG)含量測定 參考文獻[24]。取1 g魚糜與含0.6 mol/L NaCl的10 mmol/L磷酸緩沖液(pH=6.0)，勻漿1 min，離心(8 000×g，20 min，4 ℃)，取上清液在激發波長和發射波長為350～450 nm下測定熒光強度。羰基(CBG)含量表示為熒光強度F/mg·Pro。

1.2.8 魚糜凝膠強度的測定 對解凍的魚糜樣品加入20%冰水空擂60 s后，加入3%的食鹽鹽擂30 s后，立即灌入折徑為52 mm的腸衣。40 ℃水浴60 min，90 ℃水浴20 min，冰水浴30 min。取出切成25 mm魚糕段，保持切面整齊、光滑、無破裂口。使用直徑5 mm的球形探頭，載物平臺與探頭速度為1 mm/s，用質構儀測定凝膠強度[25-26]。

1.2.9 魚糜凝膠超微結構測定 參考文獻[27]的方法。將魚糕段切成厚度為3 mm的圓片，用真空冷凍干燥機凍干48 h(-80 ℃)。分別從凍干的魚糕圓片樣中切下適宜大小的薄片樣品，置于掃描電子顯微鏡下觀察魚糜凝膠超微結構，放大倍數為10 000倍。

2 結果與分析

2.1 海藻糖最佳添加量的篩選

2.1.1 海藻糖對SSP含量的影響 海藻糖對SSP含量的影響見圖1。6組樣品的SSP蛋白含量整體上均隨凍藏期的延長而下降，但下降程度有所不同。凍藏至12周時，6%組和8%組的SSP含量極顯著高于其他組(P<0.01)，且6%組高于8%組；相對于凍藏0周時SSP含量的初始值，12周時6%組SSP含量下降程度[(16.64±4.06)%]明顯低于0%組[(28.33±2.52)%]。由以上結果可知，海藻糖可有效延緩草魚魚糜SSP含量在凍藏期間的下降，且添加量為6%的抗凍效果最好。張靜雅[28]研究發現5%海藻糖能較好地延緩淡水魚魚糜SSP在凍藏期間的下降；但也有研究[29-31]表明5%，9%，10%海藻糖具有相似的延緩作用。與本研究結果相似。

SSP在魚糜凝膠三維結構形成的過程中起重要的作用，其含量的下降不利于魚糜凝膠結構的形成。SSP的損失與魚糜蛋白質凍藏期間的變性有關[32]。蛋白質的空間構象依靠分子內的氫鍵、二硫鍵、疏水鍵及靜電相互作用維持，而水分子的狀態能影響這些鍵的分布。在凍藏過程中，自由水凍結產生的大型冰晶會破壞結合水與蛋白質的結合狀態，使部分化學鍵受到破壞，這些化學鍵的斷裂將影響蛋白質的三維空間結構，引起蛋白質的變性。而海藻糖含有的游離羥基能增強自由水轉化成結合水的能力，從而減少凍結過程中冰晶的生成量，保護了蛋白質的三維空間結構；另一方面，海藻糖分子結構中含有的羥基還能與蛋白質分子中的一些基團發生反應，從而避免了蛋白質的聚集變性[29]。

不同大小寫字母分別表示在0.01和0.05水平上的差異

Figure 1 The salt-soluble protein content changes of added trehalose in grass carp surimi during frozen storage

2.1.2 海藻糖對TSH含量的影響 有研究[6]42發現，魚糜凝膠強度與魚糜蛋白TSH含量呈顯著性正相關，因此TSH含量能反映魚糜的加工品質。由圖2可知，各組的TSH含量在整個凍藏期內總體呈緩慢下降趨勢。在凍藏初期(0～4周)，各組的TSH含量呈先下降后上升的趨勢，可能是凍藏初期蛋白質表面的TSH被氧化，而隨著凍藏時間的延長,蛋白構型繼續發生變化，使蛋白質內部的TSH暴露出來，表現為TSH上升[7, 33-35]。從第6周開始，添加海藻糖各組TSH含量顯著或極顯著高于0%組(P<0.05或P<0.01)；凍藏結束時，添加6%組TSH含量[(74.94±0.51) μmol/g]高于其余各組，且極顯著高于0%組(P<0.01)；相對于凍藏0周時TSH含量的初始值，12周時6%組TSH含量下降程度[(15.86±0.72)%]明顯低于0%組[(22.30±1.85)%]。結果顯示，不同濃度的海藻糖都能延緩草魚魚糜凍藏期間TSH的下降，以6%添加量最佳，可能與藻糖具有穩定蛋白質結構的作用[15-17]有關。其他關于添加海藻糖對凍藏期間淡水魚糜TSH含量變化的研究[29]，也得到與本研究相似的結果。

不同大小寫字母分別表示在0.01和0.05水平上的差異

Figure 2 Total sulfhydryl content changes of added trehalose in grass carp surimi during frozen storage

2.1.3 海藻糖對CA活力的影響 由圖3可知，在凍藏期內，各凍藏組的CA活性整體呈下降趨勢。在凍藏初期，各組的CA活性無顯著性差異(P>0.05)；從第2周開始，添加海藻糖各組的CA活性顯著或極顯著高于0%組(P<0.05或P<0.01)，說明添加海藻糖可以明顯保護肌動球蛋白的變性。凍藏結束時，6%添加組的CA活性[(0.21±0.006 2) μmol P/(mg Pro·min)] 高于其余各組，且極顯著高于0%組(P<0.01)。相對于凍藏0周時CA活性的初始值，12周時6%組CA活性的下降程度[(35.33±7.28)%]明顯低于0%組[(58.23±9.14)%]。由此可見，海藻糖可以有效延緩凍藏期間CA活性的降低，且6%組的效果最理想，比0%組的降低率低(22.90±8.21)%，可以有效防止魚糜蛋白變性，延長魚糜的凍藏期。有其他相關報道也與本研究得到了類似的結果，發現海藻糖能延緩鳙魚肌原纖維蛋白溶液[36]、羅非魚魚糜[37]、金鯧魚魚糜[38]凍藏期間CA活性的下降。

CA活性是體現魚糜肌動球蛋白穩定性的重要指標，其活性越高，肌動球蛋白的變性程度就越小，魚糜的品質就越好。有研究認為凍藏期間CA活性的改變主要有以下幾點原因：① 肌動球蛋白重鏈頭部具有CA活性區域，肌動球蛋白變性將導致CA活性下降[39]；② CA活性區域含有的兩個活性巰基,在凍藏過程中容易被氧化形成二硫鍵，從而導致區域構象發生變化，也會使CA活性改變[40]；③ 在凍藏期間，自由水形成的大型冰晶破壞了結合水與蛋白質的結合狀態，冰晶之間的相互擠壓也會使蛋白質的三維結構發生變化，進而使肌動球蛋白重鏈頭部的CA活性區域暴露，導致CA活性下降。有理論[29]認為海藻糖分子中的游離羥基能在蛋白質分子表面形成氫鍵,穩定蛋白質的分子結構；同時，海藻糖能增強自由水轉化成結合水的能力，既增強了結合水與蛋白質的結合狀態，又減少了大型冰晶的生成量，從而保護了蛋白質結構，抑制了CA活性的下降。本試驗采用生產實際中常用的機械采肉法，通常原料為剖片后的整個魚片，魚體腹部含有的大量脂肪混入采得的魚糜中，有報道[24]稱蛋白質的氧化與脂質的氧化呈正相關，且二者可能存在相互促進的作用，而權國波等[41]研究發現海藻糖能抑制細胞脂質的過氧化損傷。因此根據本試驗結果推測，海藻糖還可能通過抑制凍藏過程中脂肪氧化產生過氧化物而抑制了蛋白質的氧化變性。綜上所述，推測添加海藻糖不僅通過穩定蛋白結構也可能通過抑制脂肪次級氧化，在保持CA活性方面發揮積極的作用。

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Figure 3 Ca2+-ATPase activity changes of added trehalose in grass carp surimi during frozen storage

2.1.4 海藻糖對CBG含量的影響 蛋白質氧化的過程中會形成CBG(醛基和酮基)，故CBG含量被廣泛地用于測量蛋白質的氧化程度。在凍藏過程中會發生蛋白的氧化變性，氨基酸側鏈上含有的氨基或亞氨基對羥基自由基敏感，被氧化成CBG基團；而凍藏過程中肽骨架的斷裂也會產生CBG[42]。CBG含量能從一定程度上反應凍藏魚糜蛋白質的變性，但目前關于海藻糖對淡水魚糜在凍藏期間CBG含量變化的影響尚未見報道。由圖4可知，在整個凍藏期間，各組的CBG含量均呈上升趨勢，且凍藏前4周增勢較平緩，6～12周增加迅速。但是從第4周開始，添加海藻糖的各組CBG均低于未添加組，尤其第6周后，該差異表現為顯著(P<0.05)或極顯著 (P<0.01)；凍藏12周結束時，6%，8%，10%添加組的CBG含量極顯著低于0%，2%，4%添加組的，而6%，8%，10% 3組間并無顯著性差異(P>0.05)。相對于凍藏0周時CBG含量的初始值，12周時6%組CBG含量上升程度[(224.77±9.51)%]明顯低于0%組[(278.88±10.18)%]。考慮到工廠生產實際中的成本問題以及前述各指標的結果，添加6%海藻糖能較好地節約生產成本。本試驗從CBG變化的角度證明了海藻糖對淡水魚糜凍藏期間的蛋白穩定性起到一定的保護作用。鑒于脂肪的次級氧化會產生自由基[24]，因此，推測這種保護作用也可能與海藻糖能抑制脂肪的次級氧化有關。

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2.2 海藻糖最佳添加量的抗凍效果分析

于-20 ℃凍藏6個月后，分別測定了對照組和海藻糖適宜加量組(6%)草魚魚糜的凝膠強度和超微結構，進一步分析海藻糖對草魚魚糜凍藏品質的影響，結果見圖5、6。適宜添加組的凝膠強度極顯著高于對照組(P<0.01)。且適宜添加組的凝膠強度達3 026 g·mm，符合農業部SC/T 3702—2014標準AA級，說明凍藏6個月后，魚糜品質仍保持良好。經掃描電鏡觀察，適宜添加量組魚糜凝膠內部網狀結構緊實、致密、空洞較少，纖維粗壯；而對照組的魚糜凝膠內部網狀結構表現為疏松多孔、三維網狀結構中的纖維較為纖細。鄧海萍等[43-44]也發現添加多糖類物質能提高魚糜的凝膠性能。

不同大小寫字母分別表示在0.01和0.05水平上的差異

圖6 最佳添加量組、對照組超微結構的比較

Figure 6 The comparison in ultrafine 3-dimentional network of best addition amount group and control group

3 結論

通過在機械采肉制備的草魚魚糜中添加不同量的海藻糖，以草魚魚糜鹽溶性蛋白含量、總巰基含量、Ca2+-ATP酶活力和羰基含量為指標，并結合生產實踐中的成本控制，篩選出海藻糖在草魚魚糜中的最佳添加量為6%；同時研究適宜添加量的海藻糖對草魚魚糜凝膠強度和微觀結構的影響。發現海藻糖能有效保護凍藏期間草魚魚糜蛋白質，表現為延緩鹽溶性蛋白的損失、總巰基含量的降低、Ca2+-ATP酶活力的降低和羰基的形成；其中，尤以6%添加量的草魚魚糜蛋白質變性程度最小，凍藏品質最佳，凍藏6個月后凝膠強度仍能達到AA級，微觀結構較為緊實。綜上所述，海藻糖的添加可能改變了草魚魚糜蛋白的結構，使其變得更穩定，從而表現出更好的凍藏穩定性，因此將其作為一種抗凍劑應用在淡水魚糜的凍藏過程中，具有廣闊的市場前景。

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Effects of trehalose on quality of grass carp surimi during frozen storage

SUZhao

HUQiang

LIShu-hong

DANJing

LIMei-liang

LINLing

BAIZhi-zi

YANGJuan

KEQin-qin

(CollegeofFoodScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China)

This paper conducts a study of the inhibitory effect of trehalose on the protein denaturation of grass carp frozen surimi. At first, salt-soluble protein, total sulfhydryl, Ca2+-ATPase activity and carbonyl group were monitored during the frozen-storage period (12 weeks). When the addition of trehalose was 6%, the inhibitory effect on protein denaturation was the best. Then, the determination of structure characteristics of the group with the addition amount (6%) was conducted after surimi was frozen for six months. Results: the gel strength of the group with best addition amount reached 3 026 g·mm, much higher than the control group (P<0.01). Scanning electron microscope found that ultrafine 3-dimentional network structureof surimi gel was firmer, more compacted and tougher. The trehalose (6%) has an inhibitory effect on the protein denaturation of grass carp frozen surimi，delays the reduction of frozen surimi quality, and has a good application prospect as a potential commercial surimi antifreeze.

grass crap surimi; trehalose; cryoprotectants; cryoprotective effects; surimi quality

四川省科技計劃支撐項目(編號：2014NZ0003)

蘇趙，男，四川農業大學實驗師，大專。

李樹紅(1975—)，女，四川農業大學副教授，博士后。 E-mail:lish@sicau.edu.cn

2017—05—07

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.031