超聲輔助提取—HPLC—ICP—MS同時測定水產(chǎn)及其制品中3種形態(tài)汞的含量

喬 晴

何兵兵

王向軍

李 辰

劉軍紅

(河南出入境檢驗檢疫局，河南 鄭州 450003)

超聲輔助提取—HPLC—ICP—MS同時測定水產(chǎn)及其制品中3種形態(tài)汞的含量

喬 晴

何兵兵

王向軍

李 辰

劉軍紅

(河南出入境檢驗檢疫局，河南 鄭州 450003)

建立了采用超聲輔助提取，高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定水產(chǎn)及其制品中汞形態(tài)分析的方法。在鹽酸+L-半胱氨酸體系下，對樣品進行超聲輔助萃取，以10 mmol/L乙酸銨+0.10%L-半胱氨酸緩沖鹽與甲醇(體積比98∶2)組成流動相，用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜儀同時檢測無機汞、甲基汞和乙基汞的含量。無機汞、甲基汞和乙基汞的檢出限(3S/N)分別為0.18，0.09，0.15 ng/mL，標準曲線回歸方程相關(guān)系數(shù)(R)均>0.999。以實際樣品對無機汞、甲基汞、乙基汞進行加標回收試驗，回收率在78.5%～96.8%，相對標準偏差(RSD)≤3.0%。經(jīng)對標準物質(zhì)進行檢測，測得值與標準值吻合。該方法準確可靠、簡單快速、精密度及準確度結(jié)果理想，可用于實際水產(chǎn)及其制品中汞形態(tài)的分析。

無機汞；甲基汞；乙基汞；水產(chǎn)品；超聲輔助提??；高效液相色譜；電感耦合等離子體質(zhì)譜

汞俗稱水銀，是對人類和高等生物具有危害的有毒元素之一，揮發(fā)性強，熔點低，毒性較大。汞是在生態(tài)系統(tǒng)中能完善循環(huán)的唯一重金屬，汞及其化合物容易被生物體吸收，通過食物鏈(尤其是水生生物的食物鏈)富集并傳遞，最終導(dǎo)致水生動物體內(nèi)汞濃度大大超出環(huán)境水體中的汞濃度。水產(chǎn)類膳食是人類攝入汞的主要途徑。不同形態(tài)的汞及其化合物都會威脅人類健康，造成人體免疫、神經(jīng)以及心血管等多系統(tǒng)損害，并且還有致癌作用。中國GB 2762—2012《食品中污染物限量》規(guī)定魚類中甲基汞限量為0.5 mg/kg，食肉魚類為1.0 mg/kg；日本規(guī)定水產(chǎn)品中甲基汞限量為0.3 mg/kg(不適用河川淡水魚)[1]；美國規(guī)定魚類甲基汞限量為1.0 mg/kg(濕重)[2]。

目前汞的形態(tài)分析主要有GC—MS聯(lián)用法、HPLC—AFS聯(lián)用法、HPLC—UV聯(lián)用法、HPLC—ICP—MS聯(lián)用法等[3-5]。GC—MS聯(lián)用法檢測速度快靈敏度高，然而雜質(zhì)干擾多，前處理復(fù)雜；HPLC—UV聯(lián)用法選擇性差，基體干擾嚴重，靈敏度低，操作復(fù)雜，目前已很少使用；HPLC—AFS聯(lián)用法測定的靈敏度雖然能滿足檢測需求，但需要加入強氧化劑將有機汞氧化成無機汞，可能會出現(xiàn)反應(yīng)不充分，轉(zhuǎn)化率低的缺陷，實際應(yīng)用性差。而HPLC—ICP—MS聯(lián)用法可以獲得更低的檢出限和更好的靈敏度，選擇性強，已成為形態(tài)分析技術(shù)中的首選。

本試驗依據(jù)GB 5009.17—2014《食品安全國家標準 食品中總汞及有機汞的測定》中第二篇食品中甲基汞的測定方法(液相色譜—原子熒光光譜聯(lián)用方法)，通過對超聲提取工藝的優(yōu)化，以及采用液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法，并對測定條件進行優(yōu)化，旨在建立一套適用于同時分析水產(chǎn)及其制品中3種汞形態(tài)含量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：ICP-MS 7900型，美國安捷倫公司；

高效液相色譜：HPLC 1200型，美國安捷倫公司；

霧化器：ICP-MS PFA型，美國安捷倫公司；

Zorbax Eclipse Plus C18：150 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫公司；

電子天平：XP205型，瑞士梅特勒-托利多公司；

高速冷凍離心機：Z300K型，德國哈默公司；

超聲波清洗機：KANG SHIJIE PL-J60型，0.45 μm濾膜，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；

超純水系統(tǒng)：Millipore型，法國密理博公司。

1.2 試劑與標準品

試驗用水：符合GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水，超純水系統(tǒng)制備；

乙酸銨：分析純，北京化工廠；

甲醇：色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；

氫氧化鈉：優(yōu)級純，國藥化學(xué)試劑有限公司；

L-半胱氨酸鹽酸鹽：生化試劑，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；

甲基汞標準溶液：GBW 08675，(63.6±2.4) μg/g，國家標準物質(zhì)研究中心；

乙基汞標準溶液：GBW(E) 081524，(76.4±2.8) μg/g，國家標準物質(zhì)研究中心；

無機汞標準溶液：GBW 08617，1 000 μg/mL，國家標準物質(zhì)研究中心。

1.3 溶液的配制

1.3.1 鹽酸溶液(5 mol/L) 準確量取41.66 mL鹽酸，用水稀釋定容至100 mL。

1.3.2 氫氧化鈉溶液(6 mol/L) 準確量取24 g氫氧化鈉，溶于水并定容至100 mL。

1.3.3 氨水溶液(20 mL/100 mL) 準確量取10 mL氨水，緩慢倒入50 mL水中，混勻。

1.3.4 提取溶液(5 mol/L鹽酸+0.10%L-半胱氨酸) 稱取0.1 gL-半胱氨酸,用水溶解，緩慢加入41.66 mL鹽酸，用水稀釋定容至100 mL。

1.3.5 流動相 流動相A(10 mmol/L 乙酸銨，0.10%L-半胱氨酸，pH=7.5)：稱取0.771 g乙酸銨和1 gL-半胱氨酸，用水溶解，加水稀釋定容至1 000 mL。用20 mL/100 mL氨水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣30 min；流動相B為甲醇。

1.3.6 甲基汞標準儲備液(2 μg/mL) 準確稱取0.786 2 g甲基汞標準溶液，用2%甲醇稀釋定容至25 mL。

1.3.7 乙基汞標準儲備液(2 μg/mL) 準確稱取0.654 5 g乙基汞標準溶液，用2%甲醇稀釋定容至25 mL。

1.3.8 無機汞標準儲備液(2 μg/mL) 準確稱取10 mL無機汞標準溶液，用5%鹽酸稀釋定容至100 mL，再分取2 mL用2 % 甲醇稀釋定容至100 mL。

1.3.9 混合標準使用液(50 ng/mL) 準確移取甲基汞標準儲備液、乙基汞標準儲備液和無機汞標準儲備液各0.625 mL，用2%甲醇稀釋定容至25 mL。使用時現(xiàn)配。

1.3.10 混合標準工作液 分別移取混合標準使用液0.0，0.1，0.2，0.4，1.0，2.0 mL于一組10 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，得到甲基汞、乙基汞和無機汞的濃度分別0.0，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL的混合標準工作液。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品處理 取可食部分，用搗碎機打成勻漿，均分成2份作為試樣，分別裝入潔凈的容器內(nèi)，密封并標記。于-18 ℃以下保存。

稱取樣品1 g(精確到0.001 g)，置于25 mL離心管中，加入10 mL提取溶液，放置過夜。在20 ℃、40 kHz、300 W下超聲萃取(超聲提取時溫度會升高，容易使無機汞揮發(fā)，所以選擇20 ℃下提取)1.5 h，期間振搖數(shù)次。于4 ℃下以4 500 r/min 離心30 min。移取4 mL上清液至25 mL刻度管中，逐滴緩慢加入氫氧化鈉溶液(6 mol/L)，調(diào)節(jié)pH至2～7，用水定容至10 mL，再用0.45 μm濾膜過濾，待測。同時作空白試驗。

1.4.2 儀器條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱；流動相：流動相A(10 mmol/L 乙酸銨—0.10%L-半胱氨酸，pH 7.5)與流動相B(甲醇)98∶2(體積比)；流速：1.0 mL/min；進樣量：50 μL。儀器參考工作條件及參數(shù)見表1。

表1 ICP—MS工作條件

1.4.3 樣品測定 依次對混合標準溶液系列、空白溶液和試樣溶液進行測定，以其標準溶液峰的保留時間定性，用標準工作曲線對試樣進行定量。按上述步驟，對同一試樣進行平行試驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理的選擇

有機汞化合物在生物樣品中容易與S牢固結(jié)合，利用有機溶劑破壞硫化物并轉(zhuǎn)變?yōu)辂u代烷基汞，是提取、分離有機汞最有效的方法之一[6-8]。常用的汞化合物的提取方法主要有堿消解提取、酸消解提取、固相微萃取、水蒸氣蒸餾和固相萃取等[9]。試驗中比較了堿消解和酸消解的提取效果，發(fā)現(xiàn)堿消解提取所需時間較長，并且在甲基汞含量較低時存在復(fù)雜的基體效應(yīng)。因此，試驗中選用鹽酸+L-半胱氨酸作為水產(chǎn)及其制品樣品汞形態(tài)分析的提取劑。

2.1.1 鹽酸濃度 選取標準物質(zhì)SRM 2976貽貝[甲基汞(28.09±0.31) μg/kg]進行測定，比較了不同濃度鹽酸的提取效果，結(jié)果見表2。

表2 鹽酸濃度對提取效率的影響

由表2可知，鹽酸濃度越大提取效率越高，當加入鹽酸濃度>5 mol/L時，提取率基本比較穩(wěn)定，但隨著鹽酸濃度增加，中和鹽酸需要的堿溶液過多，使樣品溶液中離子濃度過高，對ICP—MS檢測器有影響。因此，鹽酸提取的濃度選擇5 mol/L。

2.1.2L-半胱氨酸的濃度L-半胱氨酸中的S與Hg結(jié)合，可以形成金屬-半胱氨酸絡(luò)合物，在一定的酸度下，可將樣品中不同形態(tài)的汞提取出來。試驗比較了在提取液中鹽酸濃度不變的情況下，分別加入不同量的L-半胱氨酸，使其含量分別為0.02%，0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，通過對標準物質(zhì)SRM 2976貽貝[甲基汞(28.09±0.31) μg/kg]中提取的甲基汞含量進行上機測定，結(jié)果見表3。

由表3可知，0.10%的L-半胱氨酸對水產(chǎn)品及其制品樣品中甲基汞的提取效果最好。

表3 L-半胱氨酸濃度對提取效率的影響

2.1.3 超聲提取時間 選取標準物質(zhì)SRM 2976貽貝[甲基汞(28.09±0.31) μg/kg]，加入25 μg/kg的無機汞、甲基汞和乙基汞混合標準溶液，在20 ℃下分別超聲提取0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 h，期間振搖數(shù)次，測定無機汞、甲基汞和乙基汞的加標回收率，結(jié)果見表4。

表4 不同超聲提取時間的加標回收率

由表4可知，超聲提取1.5 h時，3種形態(tài)汞的加標回收率已能夠滿足檢測要求。綜合考慮工作效率等因素，最終選擇超聲提取時間為1.5 h。

2.2 流動相的選擇

2.2.1 乙酸銨濃度的影響 在流動相中加入乙酸銨，可以穩(wěn)定流動相的酸度，改善峰型和拖尾現(xiàn)象[10]。試驗分別比較了不同濃度的乙酸銨對不同形態(tài)汞的分離效果。結(jié)果表明，隨著乙酸銨濃度的增加，儀器響應(yīng)值增加，各種形態(tài)汞的峰型有所改善，出峰時間縮短，拖尾逐漸有所改善。但當乙酸銨濃度達到10 mmol/L以上時，各種汞形態(tài)的色譜峰拖尾不再有明顯改善，尤其是無機汞和甲基汞分離效果變差(見圖1)。故選擇乙酸銨的濃度為10 mmol/L。

2.2.2 絡(luò)合劑的影響 在用反相液相色譜分析無機汞、甲基汞和乙基汞時，加入適當?shù)慕j(luò)合劑，使其和樣品中的各形態(tài)汞反應(yīng)，形成非極性絡(luò)合物，從而實現(xiàn)在C18柱上保留分離[11-13]。L-半胱氨酸無毒無害，親水性較強，絡(luò)合能力較弱，檢測時間短。通過比較不同濃度的L-半胱氨酸對汞形態(tài)的分離效果和峰形影響，結(jié)果表明，L-半胱氨酸的濃度對汞化合物的分離和保留有很大影響。當不加入L-半胱氨酸時，不同形態(tài)的汞無法分離，譜圖上出現(xiàn)單峰，或者出峰時間過長；隨著L-半胱氨酸的加入，3種形態(tài)汞的分離度明顯改善，拖尾現(xiàn)象減弱，靈敏度大大提高，見圖2。當L-半胱氨酸濃度達到0.10%及其以上時，這3種形態(tài)汞的峰形、保留時間和靈敏度不再有明顯變化，且對色譜柱的損害較大。綜合考慮，選擇0.10%L-半胱氨酸作為流動相中的絡(luò)合劑，需臨配現(xiàn)用。

圖1 不同濃度乙酸銨的色譜圖

圖2 不同濃度L-半胱氨酸的色譜圖

2.2.3 pH的影響 試驗考察了流動相的pH值(pH 4.0～8.0)對3種形態(tài)汞的分離度、保留時間、響應(yīng)值等的影響。結(jié)果表明：在試驗范圍內(nèi)，當pH較小時，色譜峰形較差；當pH>6.0時，色譜峰形開始有所改善，但隨著pH的增大，3種形態(tài)汞的分離度、保留時間變化不大。當pH為7.5時，色譜峰形相對更對稱尖銳，見圖3。因此，最終選擇流動相的pH為7.5。

2.2.4 甲醇濃度的影響 試驗考察了流動相中不同濃度的甲醇(2，5，8 mL/100 mL)對不同形態(tài)汞的保留時間和分離效果的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著甲醇濃度的增加，會導(dǎo)致汞化合物分離效果逐漸變差，可能是ICP—MS的采樣錐和截取錐的錐口積碳，造成 ICP—MS的信號不穩(wěn)定。因此試驗最終選用 2 mL/100 mL 的甲醇作為流動相，能達到理想的分離效果。

圖3 不同pH值的色譜圖

圖4 不同濃度甲醇的色譜圖

2.3 分離效果

采用1.4試驗條件測定5 ng/mL汞混合標準溶液，無機汞、甲基汞、乙基汞的保留時間分別為1.751，2.501，5.201 min，色譜分離效果好，見圖5。

2.4 標準曲線和檢出限

待儀器狀態(tài)穩(wěn)定后，使用調(diào)諧液對儀器雙電荷、靈敏度、氧化物、分辨率等指標進行調(diào)諧，達到最優(yōu)。以色譜峰面積為縱坐標，標準溶液中3種形態(tài)汞的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限(3S/N)，結(jié)果見表5。

圖5 汞形態(tài)的色譜分離圖

汞化合物線性范圍/(ng·mL-1)線性方程相關(guān)系數(shù)檢出限/(ng·mL-1)無機汞0.5^10.0Y=56972X+4650.99990.18甲基汞0.5^10.0Y=55865X+1160.99990.09乙基汞0.5^10.0Y=52340X+1821.00000.15

2.5 回收率和精密度

選取三文魚肉樣品，根據(jù)GB 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中方法確認要求，進行3個不同濃度水平的加標回收率和精密度試驗，結(jié)果見表6。

2.6 標準物質(zhì)的驗證

對標準物質(zhì)SRM 2976貽貝[甲基汞(28.09±0.31) μg/kg]進行測定，實際測定值27.82 μg/kg，RSD為1.66%，3種汞形態(tài)的色譜圖見圖6。

2.7 實際應(yīng)用

選取市售部分水產(chǎn)品及其制品，分別測定樣品中的無機汞、甲基汞及乙基汞的含量，同時在樣品中添加1 ng/mL濃度水平的無機汞、甲基汞及乙基汞混合標準溶液，進行加標回收測定，結(jié)果見表7。

表6 加標回收率和精密度結(jié)果?

? N.D.表示未檢出。

圖6 標準物質(zhì)的色譜圖

由表7可知，所測水產(chǎn)及其制品中的汞主要以甲基汞的形態(tài)存在，乙基汞均未檢出，未經(jīng)加工過的冰鮮水產(chǎn)品中的甲基汞較高。依據(jù)中國GB 2762—2012的規(guī)定，魚類中甲基汞含量≤0.5 mg/kg，食肉魚類為≤ 1.0 mg/kg，本試驗所測的水產(chǎn)品及其制品中甲基汞含量均未超標。

3 結(jié)論

本試驗建立了5 mol/L鹽酸+0.10%L-半胱氨酸超聲輔助萃取前處理，HPLC—ICP—MS聯(lián)用技術(shù)測定水產(chǎn)品中甲基汞、乙基汞和無機汞的方法。該方法簡單快速，提取效率高，精密度及準確度結(jié)果理想，克服了GB 5009.17—2014

表7 樣品分析結(jié)果?

? N.D.表示未檢出。

測定甲基汞方法實際應(yīng)用性差的缺點，可廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)及其制品中汞形態(tài)的分析。但是由于甲基汞和無機汞化學(xué)性質(zhì)相似，如何使甲基汞和無機汞達到更加理想的分離效果，同時獲得更好的靈敏度，是汞形態(tài)分析技術(shù)下一步面對的最大問題。

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Simultaneous determination of the content of the different mercury speciation in aquatic products by liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry coupled with ultrasonic-assisted extraction

QIAOQing

HEBing-bing

WANGXiang-jun

LIChen

LIUJun-hong

(HenanEntry-ExitInspection&QuarantineBureauofP.C.R,Zhengzhou,Henan450003,China)

Ultrasonic assisted extraction coupled with high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry was developed for the determination of mercury speciation in aquatic products. Using ultrasonic assisted extraction for sample in HCl +L- cysteine system, with 10 mmol/L ammonium acetate +0.10%L- cysteine buffer and methanol (98∶2) system consisting of mobile phase, and detected the content of inorganic mercury and methyl mercury and ethyl mercury by high performance liquid chromatography- inductively coupled plasma mass spectrometry. The detection limits (3S/N) of inorganic mercury, methyl mercury and ethyl mercury were 0.18, 0.09, 0.15 ng/mL, respectively. The correlation coefficient (R) of the regression equation of the standard curve was above 0.999. Inorganic mercury and methyl mercury, ethyl mercury were spiked in actual samples, the rate of recovery was 78.5%～96.8%, the relative standard deviation (RSD)≤3.0%. The standard substance was detected by this method, and the measured value was consistent with the standard value. The method is accurate, reliable, simple, rapid and accurate. It can be applied to the analysis of mercury speciation in aquatic products.

Inorganic mercury; methyl mercury; ethyl mercury; aquatic product; ultrasonic-assisted extraction; HPLC; ICP-MS

河南省科技廳科技攻關(guān)項目(編號：162102310065)

喬晴(1983—)，女，河南出入境檢驗檢疫局工程師，碩士。E-mail:89478260@qq.com

2017—05—11

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.014