四川麩醋發酵過程中有機酸及游離氨基酸含量變化分析

劉 芳

張奶英1

劉書亮1,2

敖曉琳1,2

(1. 四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2. 四川農業大學食品加工與安全研究所，四川 雅安 625014)

四川麩醋發酵過程中有機酸及游離氨基酸含量變化分析

劉 芳1

張奶英1

劉書亮1,2

敖曉琳1,2

(1. 四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2. 四川農業大學食品加工與安全研究所，四川 雅安 625014)

為了解四川麩醋發酵過程中有機酸及游離氨基酸含量的變化規律，采用高效液相色譜和氨基酸自動分析儀對發酵過程中7種有機酸及17種游離氨基酸含量進行測定。結果表明，四川麩醋發酵過程中含量最高的2種有機酸為乙酸和乳酸，隨著發酵的進行，其含量顯著增加；草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸含量較低，在發酵過程中含量略有變化。游離氨基酸含量隨著發酵的進行呈增加趨勢，從發酵初期668 mg/100 g增至1 470 mg/100 g，其中天門冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、組氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸對四川麩醋風味形成具有較大的貢獻。

四川麩醋；有機酸；游離氨基酸；主成分分析

食醋作為中國傳統的酸性調味品，不僅具有調味功能，還有緩解疲勞、促進食欲、軟化血管等保健功效[1-3]。中國傳統“四大名醋”之一的四川麩醋(以保寧醋最為著名)，以麩皮等淀粉類物質為原料，采用糖化、酒化、醋化同池發酵的工藝釀制而成[4]，具有醋香濃郁、回味甘甜的特點，深受消費者喜愛。風味物質是評價食醋品質的重要指標，包括揮發性和不揮發性成分，其中不揮發性成分包括有機酸與游離氨基酸。有機酸是食醋酸味的主要來源，氨基酸能夠豐富食醋的風味與營養，同時還是許多風味物質形成的前體。食醋的風味物質主要來源于發酵過程中微生物的代謝產物。相關研究表明，食醋發酵過程中微生物群落具有豐富的多樣性[5-6]，各理化指標及風味物質含量變化與微生物群落變化密切相關[7-8]。在發酵過程中，醋酸菌、乳酸菌和酵母菌是優勢功能微生物[9-10]，對于食醋風味的形成具有重要意義。

目前關于四川麩醋的研究多為功能菌株的篩選及產品風味物質的分析[11]，對于發酵過程中有機酸及游離氨基酸等風味物質變化規律鮮有報道，熊越[12]對四川麩醋發酵過程中風味物質變化的研究中，基于有機酸含量變化將四川麩醋發酵過程分為6個階段，但并未對其變化規律及形成原因進行深入討論。本試驗以四川某麩醋廠固態麩醋發酵過程中醋醅及同批次熟醋為對象，測定發酵過程中有機酸及游離氨基酸含量變化，旨在分析其變化規律，為四川麩醋發酵過程中的生產控制和產品品質提升提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

固態發酵池發酵過程的醋醅：采集于四川某麩醋廠，取樣時間分別為發酵第1，3，7，12，18，24，30 天，取樣點距醋醅表層40～50 cm，重復取3個發酵池，將3個發酵池醋醅樣品混合后每份約1 000 g裝于無菌食品袋中，取與醋醅同批次熟醋灌裝于500 mL玻璃瓶中，共3瓶。樣品低溫運回實驗室，置于-20 ℃冰箱保存。

1.1.2 試劑

硫酸鋅、亞鐵氰化鉀：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

甲醇、乙腈：色譜純，瑞典Oceanpak公司；

L-蘋果酸標準品：純度≥99%，美國Sigma公司；

檸檬酸標準品：純度≥99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

乳酸、乙酸、琥珀酸、草酸、酒石酸標準品：純度≥99.5%，天津市光復精細化工研究所。

1.1.3 主要儀器設備

精密電子天平： TE412-L型，德國Sartorius公司；

液相色譜儀：LC-10A2010C HT型，配LC-Solution工作站，日本Shimazu公司。

1.2 有機酸含量的測定

1.2.1 樣品處理

(1) 固態醋醅：稱取50 g醋醅，加150 mL超純水浸泡3 h，過濾后取濾液10 mL并加入亞鐵氰化鉀(106 g/L)和硫酸鋅(300 g/L)溶液各1 mL，用超純水定容至50 mL，混勻后靜置30 min，取濾液過0.45 μm 濾膜，棄去初濾液，取續濾液供HPLC分析用[13]。

(2) 液態熟醋：取10 mL醋液，加入106 g/L 亞鐵氰化鉀溶液和300 g/L 硫酸鋅溶液各2 mL，搖勻后用超純水定容至100 mL。靜置30 min，移取上清液，用0.45 μm濾膜過濾棄去初濾液，取續濾液供HPLC分析用。

1.2.2 高效液相色譜條件 色譜柱：Carbomix H-NP離子交換柱(10 μm，7.8 mm×300 mm)；流動相：2.5 mmol/L稀硫酸；流速：0.6 mL/min；進樣體積：10 μL；柱溫：58 ℃；紫外檢測器波長：210 nm。

1.2.3 有機酸標準曲線及線性回歸方程 有機酸標準品HPLC色譜圖如圖1所示，各有機酸分離良好。在相同的色譜條件下進樣，以濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)繪制出不同有機酸的標準曲線(見表1)。由表1可知，相關系數R2>0.999 0，線性范圍良好，可用于樣品定量分析。

1. 草酸 2. 檸檬酸 3. 酒石酸 4. 蘋果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 乙酸

圖1 混合有機酸標準溶液HPLC譜圖

1.3 游離氨基酸的測定

稱取適量的醋醅，將其置于60 ℃烘箱中干燥至恒重，用粉碎機將其粉碎并過60目篩。液體熟醋用0.45 μm濾膜過濾后，送國家糧食局成都糧油食品飼料質量監督檢驗測試中心，采用氨基酸自動分析儀檢測游離氨基酸含量。

1.4 數據處理與分析方法

試驗數據采用Spss 19.0進行統計，并對發酵過程中游離氨基酸含量進行主成分分析。

2 結果與討論

2.1 四川麩醋發酵過程中有機酸含量變化規律

2.1.1 發酵過程中有機酸含量變化 對四川麩醋發酵過程中7種有機酸含量進行測定，結果見表2。乙酸是四川麩醋發酵過程中含量最高的有機酸，是食醋酸味的主要來源[14]，在發酵過程中含量不斷增加。乳酸含量僅次于乙酸，在發酵過程中含量呈增長趨勢。琥珀酸為酵母菌發酵的代謝產物，具有鮮酸爽口的滋味[15]，在發酵過程中含量先增加后趨于穩定。蘋果酸在發酵過程中含量先減少后略增加。檸檬酸與草酸含量較低，在發酵過程中含量變化不明顯。發酵結束后經浸淋取醋、煎醋工藝所得即為熟醋。熟醋中草酸含量降低，可能是草酸與釀造用水中的金屬離子生成了不溶性的草酸鹽[16]。

2.1.2 發酵過程中主要有機酸含量變化分析 四川麩醋發酵是典型的“三邊發酵”，乙酸和乳酸為發酵過程中含量最高的2種有機酸[17]，根據主要有機酸含量變化可粗略分為糖化酒化階段、醋酸發酵階段和后熟階段。發酵第1～3天主要為糖化酒化期，在此階段乳酸和乙酸含量顯著增加，由于該階段以厭氧發酵為主，乳酸菌大量生長繁殖產生乳酸，由于發酵初期基質總酸含量低，酵母菌在酒精發酵過程中可生成琥珀酸，同時將丙酮酸轉化為乙酸[18]，醋酸菌通過蘋果酸/琥珀酸回補偶聯有氧呼吸產生乙酸[19]。第3～24天主要為醋酸發酵階段，在此階段乙酸含量大幅增加，乳酸含量呈緩慢增長趨勢。實際生產中，自發酵第7天起每隔2～3 d進行一次翻醅，使醋酸菌在有氧條件下大量生長繁殖，將“三邊發酵”生成的乙醇氧化為乙酸[20]，醋醅底部的乳酸菌在痕量氧氣的條件下生長產生乳酸。發酵第24～30天主要為后熟期，在此階段乳酸含量降低而乙酸含量增加，可能是基質中的乙醇與葡萄糖被耗盡，醋酸菌將乳酸作為碳源利用[21]。

2.2 四川麩醋發酵過程中游離氨基酸含量及其主成分分析

2.2.1 發酵過程中總游離氨基酸含量變化 氨基酸不僅是人體重要的營養物質，還是食品中重要的呈味物質[22-25]。四川麩醋發酵過程中游離氨基酸含量變化見表3。由表3可知，發酵過程中游離氨基酸總量顯著增加(P<0.05)，從發酵初期(668 mg/100 g)至發酵結束(1 470 mg/100 g)增加了2倍。根據游離氨基酸的味覺強度，可將其分為鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸[26]。在發酵過程中，三類氨基酸變化趨勢基本一致：發酵初期快速增加，隨后略有減少，發酵結束后所得熟醋中鮮味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸的含量分別為243.06，562.67，446.14 mg/100 mL。成品食醋中甜味和鮮味明顯而苦味不明顯，可能是苦味氨基酸不具有味覺活性，在食醋中其苦味被甜味掩蓋[27]。熟醋中必需氨基酸(EAA)含量達到總氨基酸(TAA)含量的40%以上，必需氨基酸含量與非必需氨基酸(NEAA)含量的比值高于60%，符合1973年WHO與FAO提出的較好氨基酸組成的標準[28]。

表2 四川麩醋發酵過程中各種有機酸的含量變化

表3 四川麩醋在發酵過程中各種游離氨基酸的含量?

? 同行中肩標小寫字母不同表示差異顯著(P<0. 05) ，相同表示差異不顯著。必需氨基酸：Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys。非必需氨基酸：Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Tyr、His、Arg、Pro。鮮味氨基酸：Asp、Glu、Lys。甜味氨基酸：Gly、Ser、Thr、Ala、Pro、His。苦味氨基酸：Val、Met、Ile、Leu、Arg。

2.2.2 不同發酵時期醋醅中游離氨基酸主成分分析 對四川麩醋發酵過程中游離氨基酸含量進行主成分分析，結果見表4。由表4可知，前2個主成分特征值均>1，累計貢獻率達96.976%，說明前2個主成分包含了發酵過程中游離氨基酸原始數據97%左右的信息。根據累計貢獻率≥85%的原則，選擇前2個因子繪制因子載荷圖。由圖2可知，絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸含量在因子1的正方向上有較高的載荷，賴氨酸、精氨酸在因子1的負方向有較高的載荷；天門冬氨酸、酪氨酸和組氨酸在因子2的正方向有較高的載荷。綜上分析可知，絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天門冬氨酸、酪氨酸和組氨酸對四川麩醋風味的形成具有較大貢獻，與張璟琳等[29]的研究結果一致。

表4 方差貢獻分析表

圖2 四川麩醋發酵過程中游離氨基酸主成分圖

3 結論

以發酵過程中四川麩醋醋醅為研究對象，對發酵過程中有機酸與游離氨基酸含量進行定量分析。按照生料發酵食醋有機酸生成規律[30]，可將發酵過程粗略分為糖化酒化期、醋酸發酵期、后熟期3個階段。乙酸和乳酸為四川麩醋中的主要有機酸，在發酵過程中含量上升明顯，相關研究表明四川麩醋發酵過程中乳酸含量明顯高于鎮江香醋與山西老陳醋，可能與四川麩醋獨特的發酵回槽工藝有關[31-33]。氨基酸作為四川麩醋中重要的呈味物質，在發酵過程中含量呈先增加后減少的趨勢，發酵結束后含量最高的3種呈味氨基酸分別為丙氨酸、亮氨酸和纈氨酸，是四川麩醋中滋味貢獻較大的3種游離氨基酸。本研究為闡明四川麩醋風味物質的形成機理提供了基礎數據，同時為四川麩醋規模化生產工藝的優化及產品品質的提升提供了參考數據。

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Changes of organic acids and free amino acids in fermentation process of Sichuan bran vinegar

LIUFang1

ZHANGNai-ying1

LIUShu-liang1,2

AOXiao-lin1,2

(1.CollegeofFoodSichuanAgricultureUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China;2.SichuanAgricultureUniversityResearchCentreofFoodProcessingandSafty,Ya’an,Sichuan625014,China)

In order to investigate the changes of organic acids and free amino acid during fermentation process of Sichuan bran vinegar, 7 kinds of organic acids and 17 kinds of free amino acid content were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) and automatic amino acid analyzer. The results showed that during fermentation process, acetic acid and lactic acid were the main organic acids of Sichuan bran vinegar, and the contents increased significantly. The contents of oxalic acid, citric acid, tartaric acid, malic acid and succinic acid were low, and there was no obvious change. The contents of free amino acids increased significantly from 668 mg/100 g to 1 470 mg/100 g during the early stage. Among them, Asp, Ser, Glu, Gly, Ala, Val, His, Ile, Tyr, Pro gave a great contribution to the Sichuan bran vinegar.

Sichuan grain vinegar; organic acid; free amino acid; principal component analysis

四川省農業科技成果轉化資金項目(編號：14NZ0012)

劉芳，女，四川農業大學在讀碩士研究生。

劉書亮(1968—)，男，四川農業大學教授，博士。 E-mail：lsliang999@163.com

2017—04—06

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.003