PFKFB3在結腸癌患者中的表達及其臨床意義

章密密， 何躍君

徐州醫學院第二附屬醫院普通外科, 徐州 221006

·短篇論著·

PFKFB3在結腸癌患者中的表達及其臨床意義

章密密， 何躍君

徐州醫學院第二附屬醫院普通外科, 徐州 221006

目的： 檢測6-磷酸果糖激酶-2/果糖雙磷酸酶-2同工酶3(PFKFB3)在大樣本結腸癌患者中的表達情況及其臨床意義。方法： 用反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和免疫組化法分別檢測156例結腸癌患者癌和癌旁組織中PFKFB3的mRNA和蛋白表達水平，分析其與結腸癌臨床病理特征及預后的關系。結果： PFKFB3的mRNA和蛋白表達在114例(73.1%)患者的結腸癌組織中高表達。結腸癌組織中PFKFB3的mRNA水平高表達與脈管內癌栓形成、淋巴結轉移和TNM分期相關(P<0.05)。PFKFB3 mRNA高表達患者的生存期短于低表達患者(P<0.05)。結論： PFKFB3在結腸癌患者癌組織中高表達，PFKFB3的mRNA水平高表達與患者惡性表型及不良預后相關。

結腸癌; PFKFB3; 臨床病理特征; 預后

結腸癌發病率在我國逐年升高。最新的統計數據[1]顯示，結腸癌在我國各種腫瘤中發病率居第3位。研究[2]表明，結腸癌的發生伴隨著細胞能量代謝的改變。癌細胞即使在有氧條件下也優先利用糖酵解途徑來提供能量，這一現象被稱為腫瘤細胞的有氧糖酵解，也稱為“Warburg效應”[3]。6-磷酸果糖激酶-1(PFK-1)是糖酵解途徑的關鍵酶，其最重要的變構激活劑是2,6雙磷酸果糖(F2,6P2)。而6-磷酸果糖激酶-2/果糖雙磷酸酶-2同工酶3(PFKFB3)是促進F2,6P2合成最重要的酶，因此具有協同促進調節腫瘤細胞糖酵解的作用。PFKFB3已被發現在多種腫瘤中高表達[4]。然而，有關PFKFB3在結腸癌中表達的大樣本研究及其臨床意義研究較少。因此，本研究擬檢測PFKFB3在大樣本結腸癌患者中的表達情況，并結合相關臨床病理資料分析PFKFB3的表達與結腸癌臨床病理特征和預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2005年1月至2015年12月在徐州醫學院第二附屬醫院普通外科住院接受手術并接受術后規范治療的156例結腸癌患者。其中男性89例，女性67例；年齡18～89歲，平均年齡(68.5±17.6)歲。患者術前均未接受放化療以及腫瘤靶向治療。術中收集手術切除的新鮮腸癌組織與配對的癌旁組織。標本采集后立即置于液氮中，隨后于-80℃冰箱中保存待用。所有患者均由同一組醫師進行根治性手術，均經病例證實為結腸癌。其中，右半結腸癌62例，橫結腸癌10例，左半結直腸癌84例；病理類型均為腺癌；腫瘤分化Ⅰ級15例，Ⅱ～Ⅲ級120例，Ⅲ級21例。所有病例均有完整隨訪資料，隨訪截至2015年12月。患者總生存時間為從手術時間至隨訪截止時間。本研究經徐州醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 RT-PCR法檢測癌和癌旁組織中PFKFB3的表達 用TRIzol法提取結腸癌和癌旁組織總RNA。取1 μg總RNA樣品按cDNA反轉錄試劑盒說明合成cDNA，用TaKaRa公司的SYBR實時定量PCR試劑盒進行RT-PCR反應。目的基因PFKFB3的引物序列正義鏈：5′-CCT CAC TCG CAG CCA CTT CT-3′；反義鏈：5′-CAG TTC CTA CTC AAT TCC AA-3′。內參基因β-actin的RT-PCR引物序列正義鏈：5′-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3′；反義鏈：5′-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3′。引物均由上海生工生物合成有限公司合成。反應采用兩步法在StepOnePlusTM實時熒光定量PCR系統進行，反應條件為：預變性95℃ 1 min，變性95℃ 5 s，退火和延伸60℃ 30 s；共進行40個循環。癌組織和癌旁組織中PFKFB3 mRNA的表達差異采用相對定量法(2-ΔΔCt法)計算。

1.3 免疫組織化學染色法檢測癌和癌旁組織中PFKFB3的蛋白表達 制作4 μm石蠟切片，常規處理后，采用EnVision二步法和DAB顯色。PFKFB3一抗按1∶150稀釋。

2 結 果

2.1 PFKFB3在結腸癌組織中的表達情況 RT-PCR法檢測(圖1)結果顯示：156例結腸癌患者中，114例(73.1%)癌組織中PFKFB3的mRNA表達水平高于癌旁組織(P<0.05)，平均為癌旁組織中PFKFB3 mRNA表達水平的2.3倍。免疫組化法結果(圖2)顯示：癌組織中PFKFB3的蛋白水平也高于癌旁組織。

2.2 結腸癌組織PFKFB3 mRNA表達水平與結腸癌患者臨床病理特征的關系 根據癌組織中PFKFB3的mRNA相對表達水平，將156例患者分為高表達組(78例)和低表達組(78例)兩組。結果顯示：PFKFB3高表達與脈管內癌栓形成、淋巴結轉移和TNM分期相關(表1)。

圖1 RT-PCR法檢測156例結腸癌和癌旁組織中PFKFB3的mRNA表達水平

圖2 免疫組織化學染色法檢測PFKFB3的蛋白表達水平

2.3 結腸癌組織PFKFB3 mRNA表達水平與患者預后的關系 PFKFB3低表達組術后1、3、5年總生存率分別為89.7%、76.9%、65.4%，PFKFB3高表達組術后1、3、5年總生存率分別為80.8%、61.5%、51.3%；兩組生存率差異有統計學意義(P=0.02，圖3)。

表1 PFKFB3 mRNA水平與結腸癌患者臨床病理特征的關系 N=78, n

圖3 Kaplan-Meier曲線分析PFKFB3 mRNA表達水平與結腸癌患者預后的關系

3 討 論

PFKFB家族共有4個亞型，其中PFKFB3于1995年首先從腦組織中分離出來[5]；隨后在其他組織中也相繼分離出了PFKFB3[6-7]；進一步的研究[8-9]發現,PFKFB3沒有磷酸酶活性而只有激酶活性。PFKFB3是促進F-2,6-BP形成的最重要的激酶。PFKFB3被認為在腫瘤的生成和代謝過程中發揮關鍵作用，但其在大樣本結腸癌組織中的表達情況還不清楚。本研究中檢測了PFKFB3在156例結腸癌患者中的表達情況，顯示其在結腸癌組織中高表達，這與其他腫瘤中的表達情況類似[4]，提示PFKFB3在結腸癌形成過程中可能發揮重要作用。但是其促進結直腸癌腫瘤細胞生長的功能和機制還有待基礎研究進一步證實。

此外，本研究表明，PFKFB3在結腸癌組織中高表達與脈管內癌栓形成、淋巴結轉移和TNM分期明顯相關，提示PFKFB3可能也參與腫瘤細胞的血行轉移和淋巴結轉移等過程，這與基礎研究[10]中發現的PFKFB3可促進惡性腫瘤的血管生成的結論相一致。基礎研究[10]表明，PFKFB3主要通過促進糖酵解過程而加快腫瘤病理性血管的生成，當阻斷 PFKFB3后，血管內皮細胞的增殖和移動受到抑制，從而減少血管的生成，達到阻斷腫瘤細胞通過血管進行擴散的目的。但是，PFKFB3通過何種機制促進結直腸癌細胞淋巴結轉移還有待進一步研究。

另外，PFKFB3高表達的結直腸癌患者預后較差，提示PFKFB3有望作為判斷結腸癌患者預后的指標，但還需要更大樣本的臨床研究支持，并與癌胚抗原(CEA)等結直腸癌的經典預后指標進行比較。

綜上所述，本研究初步揭示了PFKFB3在大樣本結直腸癌患者中的表達情況及其臨床意義。隨著對PFKFB3在結直腸癌發生發展過程中作用和機制的深入研究，將來有望通過阻斷PFKFB3而達到防治結直腸癌或者通過檢測PFKFB3判斷結直腸癌患者預后的目的。

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[本文編輯] 姬靜芳

Expression of PFKFB3 in human colon cancer and its clinical significance

ZHANG Mi-mi, HE Yue-jun

Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221006, Jiangsu, China

Objective： To investigate the expression of PFKFB3 in human colon cancer and its clinical significance.Methods： Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry were used to detect the mRNA and protein expression levels of PFKFB3 in cancer and adjacent tissues of 156 human colon cancer patients. The relationship of PFKFB3 expression with clinicopathological features and prognosis of colon cancer patients was analyzed by statistical analyses.Results： PFKFB3 mRNA and protein levels were significantly increased in tumor tissues compared to adjacent non-malignant tissues. Furthermore, correlation analysis indicated that PFKFB3 mRNA high expression in colon cancer tissues was significantly associated with intravascular cancer embolus, lymph node metastasis, and TNM staging(P<0.05). Survival analysis showed a poor prognosis of patients with high expression of PFKFB3 mRNA level(P<0.05).Conclusions： PFKFB3 is highly expressed in colon cancer. The expression level of PFKFB3 is correlated with the malignant phenotype and poor prognosis of colon cancer.

colon cancer; PFKFB3; clinicopathological features; prognosis

R 365

A

2016-08-31 [接受日期] 2017-07-12

章密密, 主治醫師.E-mail: 13914875807@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20160848