妊娠期膽汁淤積癥孕婦胎盤組織TP63的表達及其與血高膽酸的相關性

丁 晨， 吳維賓， 蔡 眉， 張慧娟*

1.上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院病理科&生物樣本庫，上海 2000302.上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院檢驗科，上海 200030

·論著·

妊娠期膽汁淤積癥孕婦胎盤組織TP63的表達及其與血高膽酸的相關性

丁 晨1， 吳維賓1， 蔡 眉2， 張慧娟1*

1.上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院病理科&生物樣本庫，上海 2000302.上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院檢驗科，上海 200030

目的： 檢測妊娠期肝內膽汁淤積癥(ICP)及正常妊娠孕婦胎盤組織TP63的表達，并探討其與血膽酸水平的相關性。方法： 選擇2012年1月至2014年12月在上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院分娩的ICP患者70例(ICP組)及正常妊娠孕婦44例(對照組)作為研究對象。采用免疫組化法評估兩組孕婦胎盤組織TP63的表達水平。采用RT-qPCR檢測不同濃度膽汁酸作用對滋養細胞株JAR細胞TP63 mRNA表達水平的影響。結果： ICP組患者胎盤滋養細胞(絕大部分為細胞滋養細胞)中TP63表達低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。胎盤組織中TP63的表達與孕婦血清膽酸水平負相關(r=-0.679，P<0.001)。高濃度膽汁酸可引起JAR細胞中TP63 mRNA的表達量下降(P<0.05)。結論： 高膽酸引起的胎盤滋養細胞中TP63低表達可通過減弱細胞增殖能力參與ICP發生發展。

妊娠期肝內膽汁淤積癥；胎盤；TP63；免疫組織化學；膽酸

妊娠期肝內膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy, ICP)是妊娠期特有的并發癥，以孕中晚期可能出現皮膚瘙癢、黃疸等不適為主要臨床表現。實驗室檢查可發現孕婦空腹血清膽汁酸水平升高或伴隨肝臟轉氨酶異常。目前多數學者認為,ICP對母體無嚴重危害，但明顯增加早產、胎兒宮內窘迫及圍產兒死亡的發生率[1-4]。ICP的病因目前尚未明確。ICP患者母血、臍血、羊水及胎糞中膽汁酸水平明顯增高，因此膽汁酸增高被認為是導致ICP不良妊娠結局的主要原因之一[5-6]。Glantz等[7]的研究發現，當母血中膽汁酸大于等于40 μmol/L時，膽汁酸每升高1 μmol/L，胎兒并發癥的發生率就增加1%～2%，提示母-胎循環系統內膽汁淤積是胎兒不良結局的關鍵[7]。

TP63是p53的同源基因，人類TP63基因位于染色體3q27-3q29區。TP63參與調控轉錄和凋亡，在表皮發育與衰老中起重要作用并與腫瘤發生有關。TP63主要表達于多種上皮組織的基底層干細胞及某些腫瘤中[8]。我們前期研究[6,9]發現，滋養細胞中TP63高表達與妊娠滋養細胞疾病的發生發展有關，且提示TP63下調可能與ICP胎盤滋養細胞老化有關。因此，本研究通過比較ICP與正常妊娠胎盤組織中滋養細胞TP63的表達差異，并通過體外實驗觀察膽汁酸處理后JAR細胞TP63的表達水平變化，探討膽汁酸能否通過TP63影響滋養細胞功能，并參與ICP發生發展。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年1月至2014年12月在上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院分娩的產婦共114例，其中ICP組70例，正常對照組44例。納入標準：對照組為足月妊娠，無妊娠并發癥及合并癥。ICP診斷標準按中華醫學會婦產科學分會產科學組頒布的ICP診療指南(2015版)[10]，即：妊娠中晚期出現空腹血清總膽酸(TBA)水平升高(≥10 μmol/L)，或伴有轉氨酶升高；皮膚瘙癢，或伴不同程度黃疸；妊娠終止后癥狀和生化指標恢復正常。排除標準：多胎妊娠、其他妊娠期皮膚病、其他引起肝功能異常的疾病。收集研究對象的基本資料，包括產婦年齡、孕周、是否初產及ICP相關實驗室檢查結果等。本研究經醫院倫理委員會審核，所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 免疫組化染色測定胎盤組織TP63表達

1.2.1 染色步驟 取所有研究對象胎盤組織1塊，取自臍帶附著點附近較厚胎盤組織的下1/2(母面側)以觀察終末絨毛。石蠟包埋組織切片(厚5 μm)經二甲苯脫蠟，高至低濃度梯度乙醇水化；加3%過氧化氫溶液，37℃、30 min，以阻斷內源性過氧化物酶；切片經水洗及蒸餾水洗后浸泡于98℃ 1 mmol/L EDTA溶液(pH 8.0)內，中檔微波處理20 min進行抗原修復；室溫靜置冷卻后，切片蒸餾水洗后，TBS沖洗3次(每次5 min)；擦去組織周圍的TBS，滴加一抗(美國Cell Signaling公司兔抗人TP63抗體，1∶100)；4℃過夜后，37℃復溫孵育30 min，切片用TBS沖洗3×5 min；滴加二抗(美國Invitrogen公司的通用型HRP標記二抗聚合物)，37℃、30 min，切片用TBS洗3次(每次5 min)。滴加DAB顯色液，顯色時間為5～10 min(顯微鏡下控制顯色程度)。自來水沖洗5 min，蘇木精染液復染30 s，0.1%鹽酸處理，自來水沖洗10 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.2 染色結果的分級及評分 免疫組化染色切片由同一名醫師采用奧林巴斯CX41顯微鏡進行閱片。每張切片隨機選取10個高倍視野進行觀察，并進行免疫組織化學染色評分(IHS)。IHS通過對著色細胞的百分數及染色強度的評分來計算。計數視野內所有完整終末絨毛結構中TP63陽性滋養細胞占總滋養細胞的百分數。染色評分參照相關文獻[11-12]，著色細胞百分比的評分為0～3分(0分：0～1%；1分：1%～10%；2分：10%～20%；3分：大于20%)。染色強度評分也為0～3分(0分：無染色，1分：淡黃色，2分：棕黃色，3分：棕褐色)。將著色細胞百分比(extent, E)和強度(intensity, I)兩組評分相乘得出數值(EI值)；用該數值來評估TP63的表達水平。

1.3 反轉錄熒光定量PCR(RT-qPCR)測定滋養細胞TP63基因表達

1.3.1 JAR細胞培養及加藥處理 滋養細胞株JAR細胞購自中國科學院細胞庫，采用含10%胎牛血清的DMEM培養于5%CO2、37℃恒溫培養箱中。分別采用含二甲基亞砜(DMSO)或200 μmol/L的CA、脫氧膽酸(DCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)處理JAR細胞24 h后收集細胞。

1.3.2 RT-qPCR檢測 采用TRIzol試劑提取各組JAR細胞總RNA后，采用加拿大ABM公司反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。并采用美國Qiagen公司的熒光定量PCR試劑盒在美國ABI公司StepOnePlus實時熒光定量PCR儀器上檢測TP63基因的表達。所用引物采用Primer Premier 5軟件設計，TP63正向引物序列：5′-GGA CCA GCA GAT TCA GAA CGG-3′，反向序列：5′-AGG ACA CGT CGA AAC TGT GC-3′；β-actin正向引物序列：5′-TTG CGT TAC ACC CTT TCT TG-3′，反向序列：5′-GCT GTC ACC TTC ACC GTT C-3′。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件處理，計數資料組間比較采用卡方檢驗；計量資料組間比較采用t檢驗及獨立樣本Kruskal-Wallis檢驗。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 兩組孕婦一般情況比較 結果(表1)表明：ICP組與對照組孕婦的平均年齡及孕產次差異無統計學意義；ICP組孕婦孕周數少于對照組，差異有統計學意義(P<0.001)；ICP組孕婦妊娠時TBA水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.001)。

2.2 胎盤組織TP63的表達及與孕婦血清TBA水平的相關性 免疫組化染色結果(圖1)表明：ICP組及對照組晚孕胎盤組織TP63定位于細胞核，絕大部分表達于細胞滋養細胞中，偶見合體滋養細胞表達；半定量評分(EI)結果表明：ICP組胎盤組織中滋養細胞TP63表達明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.001)。Spearman相關性分析結果(圖2)表明：EI評分與孕婦血清TBA水平間明顯負相關(r=-0.679，P<0.001)。

表1 兩組孕婦一般情況及產前TBA水平的比較

TBA：血清總膽酸

圖1 胎盤組織TP63免疫組化染色結果

圖2 TP63免疫組化染色EI評分與孕婦血清TBA水平的相關性分析

2.3 CA處理降低滋養細胞株TP63 mRNA表達水平 分別采用DMSO或200 μmol/L的CA、DCA、CDCA處理JAR細胞24 h后，采用RT-qPCR法檢測TP63 mRNA表達水平。結果(圖3)表明：CDCA及DCA處理后，TP63 mRNA水平明顯下降；進一步用50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L的DCA分別處理JAR細胞24 h后，與DMSO處理對照細胞相比，50 μmol/L及100 μmol/L DCA處理后的JAR細胞中TP63 mRNA的表達水平未見明顯下降，而200 μmol/L DCA處理細胞中TP63 mRNA明顯下降(P<0.01)。

圖3 CA對滋養細胞TP63 mRNA表達的影響

3 討 論

ICP是妊娠期特有的并發癥。1883年，Ahlfeld首次報道了一種復發性妊娠期黃疸，其在妊娠終止后消失。隨著越來越多的產科醫師認識到該疾病對母兒特別是胎兒的危害性，ICP近年來已成為產科的熱點之一。大量的流行病學調查及實驗研究顯示，遺傳、激素、免疫及環境因素與ICP的發生有著密切的關系。但是其病因及造成圍產兒不良妊娠結局的病理機制均不明確。ICP孕婦為高危妊娠，其最大的危害是發生難以預測的胎死宮內[13]。尤其是當血清CA≥40 μmol/L時，圍產兒發病率和死亡率顯著增高[6-7]。這可能與高濃度CA淤積的毒性效應有關[14]。Kurtulmu等[15]認為，高水平的CA對心肌的毒性在胎兒的猝死過程中可能起著重要的作用。

TP63是p53家族成員的核轉錄因子，與p53在序列結構上有很高的同源性。由于TP63具有兩個不同啟動子和多種內含子剪切方式，其基因編碼產生不同亞型的蛋白。這些蛋白分為兩大類亞型TATP63(TATP63α、TATP63β、TATP63γ)及ΔNTP63(ΔNTP63α、ΔNTP63β、ΔNTP63γ)，前者是由上游啟動子引發TP63 mRNA不同剪接產生的具有轉錄激活區的全長TP63同源異構體，后者則是由下游啟動子開始產生缺失轉錄激活區的N端被截短的異構體。這些亞型的TP63蛋白，具有不同的生物學功能，在不同的組織和不同的發育階段參與生物學事件。TP63異構體在人體組織中呈廣泛而有選擇性的表達，在正常組織中主要表達于鱗狀上皮和某些腺上皮的基底層細胞，對上皮和間葉組織正常發生、分化以及形態學的發生具有重要作用。

本研究檢測全長TP63，通過免疫組化的方法發現，ICP組病人胎盤組織中TP63蛋白的表達水平明顯低于對照組，且和孕婦血清TBA水平呈負相關。本次體外實驗表明，只有當CA濃度升高到一定程度，才會引起TP63表達的顯著下降。ICP孕婦胎盤中，引起TP63低表達的原因可能多種多樣，TP63的低表達并不是ICP特有的指標。本研究發現，ICP胎盤中TP63的低表達與高CA環境有較高的相關性，因此高CA與滋養細胞中TP63的低表達有重要聯系。高濃度的CA可通過TGR5受體[16]或者鈉氫交換體(Na+/H+exchanger)[17]誘導細胞內DNA損傷，CA亦可誘導細胞內活性氧聚集產生過氧化應激進而引起DNA損傷[18]，細胞內DNA損傷可誘發TP63表達降低，進而引起細胞生長阻滯和凋亡信號通路的激活[19]。

Li等[20]發現,TP63能夠將細胞滋養細胞維持于干細胞樣狀態，在滋養細胞株JEG3中過表達TP63會促進細胞增殖，反之，下調TP63則抑制細胞增殖。結合此次實驗結果和本研究小組以往的研究[5]，我們認為高濃度CA顯著降低了TP63的表達，由此明顯削弱絨毛細胞滋養細胞作為干細胞不斷增殖分化的能力，且使滋養細胞處于老化狀態，進而導致ICP胎盤功能下降。發生ICP時，胎盤處在高濃度CA環境下，進而可引起胎盤滋養細胞的凋亡[21]。我們的前期研究[22]也發現，在ICP小鼠模型中，胎盤滋養細胞發生水腫萎縮，細胞凋亡增加，過氧化應激程度增大。ICP患者胎盤存在明顯的絨毛間質和滋養細胞內水腫、滋養細胞凋亡增多等病理改變，可能引起胎盤功能下降，并可能引發胎兒宮內缺氧[15]。本結果提示，高濃度CA作用下TP63低表達可能為ICP滋養細胞增殖抑制以及細胞凋亡的一種潛在機制，并在ICP胎盤功能障礙發生的過程中起著重要的作用。

本研究明確了高濃度的CA會引起ICP孕婦胎盤滋養細胞TP63表達的降低，但是未探討CA引起ICP發展的病理機制及ICP胎兒不良結局的原因。由于TP63基因結構和生物學功能的復雜性，需要進一步研究來明確其在ICP疾病發展中所起的作用。

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[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍

Expression of placental tissue TP63 in pregnant women with ICP and its correlationship with excessive bile acid

DING Chen1, WU Wei-bin1, CAI Mei2, ZHANG Hui-juan1*

1.Departments of Pathology & Bio-bank, the International Peace Maternity & Child Health Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine, Shanghai 200030, China2.Departments of Laboratory, the International Peace Maternity & Child Health Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine, Shanghai 200030, China

Objective： To compare the expression of TP63 in placentas from intrahepatic cholestasis of pregnancy (ICP) patients and normal pregnant women, and to discuss the relationship between bile acid and TP63.Methods： Retrospective study was conducted on 70 placentas from ICP patients (ICP group) and 44 placentas from normal term pregnancy (control group). The samples were collected from January 2012 to December 2014 in the International Peace Maternity & Child Health Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Immunohistochemistry assay was applied to evaluate the protein expression of TP63 in placentas of the two groups. In addition, the mRNA level of TP63 was tested by RT-qPCR assay in trophoblastic cell line JAR after pretreating with different concentrations of bile acids.Results： TP63 was majorly localized in cytotrophoblasts.The expression level of TP63 in placentas from ICP group were significantly lower than that in the control group (P<0.05). Moreover, the expression of TP63 was negatively correlated with total bile acid level in maternal serum at delivery (r=-0.679，P<0.001). Treatment with high concentration of bile acids reduced the mRNA level of TP63 in JAR cells.Conclusions： Down regulation of TP63 by excessive bile acids in placental trophoblasts would contribute to the progression of ICP possibly by attenuating the proliferation of trophoblasts.

intrahepatic cholestasis of pregnancy; placenta; TP63; immunohistochemistry;bile acid

R 714.255

A

2017-04-07 [接受日期] 2017-05-20

上海市衛生和計劃生育委員會面上項目(201640033).Supported by General Fund of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (201640033).

丁 晨，碩士生，住院醫師. E-mail: reddyspnea_13@hotmail.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64070434-29905, E-mail: zhanghj815@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170287