建立一種快速鑒定大西洋鱈魚 及其制品的SYBR Green熒光PCR方法

孫曉飛，蔣 丹，萬 超，劉淑艷，吳 斌

(遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001)

建立一種快速鑒定大西洋鱈魚 及其制品的SYBR Green熒光PCR方法

孫曉飛，蔣 丹，萬 超，劉淑艷，吳 斌

(遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001)

通過大西洋鱈魚CoxI序列的比對分析，在序列的差異處設計了大西洋鱈魚的特異性引物，建立了一種大西洋鱈魚SYBR Green熒光PCR定性檢測方法，并進行了引物特異性和靈敏度分析.結果表明：檢測的大西洋鱈魚樣品和49份其他動、植物樣品DNA中，只有大西洋鱈魚樣本出現顯著擴增，6次平行反應的Ct值為23.216±0.113，5份大西洋鱈魚同屬鱈魚樣品和44種常見其他動、植樣品均無明顯擴增曲線.模擬樣品靈敏度檢測實驗顯示，該特異性引物可用于檢測質量分數為0.01%的大西洋鱈魚肉粉，靈敏度可達0.06 ng/μL.通過對市售鱈魚片檢測的驗證，該方法特異性強，靈敏度高，可用于食品中大西洋鱈魚成分真實性的鑒別.

大西洋鱈魚成分；SYBR Green熒光PCR； CoxⅠ

大西洋鱈魚(Gadusmorhua)為鱈形目鱈科鱈屬魚類，原產于北歐至加拿大及美國東部的北大西洋寒冷水域，是全世界年捕撈量最大的魚類之一.鱈魚肉味甘美、營養豐富，經濟價值極高，[1]其主要出口國是加拿大、冰島、挪威及俄羅斯.在我國鱈魚的消費量呈逐年遞增趨勢.鱈形目魚類品種繁多，由于形態學差異較小，僅用傳統方法例如鰭條數、鰓耙數和脊椎骨數難以準確地區分出鱈魚品種.而不同的鱈魚品種市場價格差異懸殊，大西洋鱈魚常被其他魚類以次充好，曾經有不法商販用 “油魚”冒充大西洋鱈魚導致食用者發生腹瀉的報道；此外，大西洋鱈魚又常被加工成魚肝油、冷凍切片等制品，鑒別更加困難.[2]因此，急需一種靈敏、特異的鑒定大西洋鱈魚及其相關制品的方法[3-4].本文采用實時SYBR Green熒光PCR技術對大西洋鱈魚成分進行了定性檢測，在PCR反應體系中加入SYBR Green熒光染料，熒光染料摻入DNA雙鏈后發射熒光信號，利用熒光信號的積累而實時監測整個PCR擴增進程，進行定性及定量分析，進而檢測大西洋鱈魚成分.該方法具有簡便、快速、準確的特點，在物種鑒定領域有著廣泛的應用前景[5-12].

1 材料與方法

1.1 材料

試劑盒及試劑：海洋動物基因組DNA提取試劑盒(天根化科技有限公司)；植物基因組DNA提取試劑盒(DP305，天根生物)；Premix Ex Taq(TaKaRa公司)；瓊脂糖(北京沃比森科技有限公司).引物由上海生工生物公司合成.

檢測樣品：大西洋鱈、綠青鱈、太平洋鱈、北太平洋無須鱈、黑線鱈、南藍鱈、黑鱈、細鱗壯鱈、阿拉斯加鱈魚、歐鰉、史氏鱘、俄羅斯鱘、小體鱘、西伯利亞鱘、達氏鱘等魚類樣品采集于北京市水產科學研究所鱘魚繁育基地；擬庸鰈、大菱鲆、牙鲆、多寶魚、黃蓋鰈、舌頭魚、太平洋鯡、大西洋鮭、大馬哈魚、紅魚、大瀧六線魚、大黃魚、中國花鱸、大西洋藍槍魚、銀槍魚、藍鰭金槍魚、條紋四鰭旗魚、藍鰭紅娘魚、黑點褐胸鱔、日本鰻、雙髻鯊、高鰭真鯊、鯽魚、草魚、鯉魚、鳙魚等魚類及其制品、大西洋鱈魚制品均購于大連市水產市場和超市.

其他樣品：雞、鴨、鵝、豬、牛、大豆、綠豆、玉米、小麥均購于超市.

1.2 儀器與設備

PCR儀(7500 Fast，美國ABI公司)；凝膠成像系統(GelDoc，美國Bio-Rad公司)；超微量分光光度計(Nanodrop 2000，美國ThermoFisher公司).

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 使用海洋動物基因組DNA提取試劑盒，提取100 mg魚、肉類樣品的總DNA；使用植物基因組DNA提取試劑盒，提取100 mg植物類樣品的總DNA.

1.3.2 實時熒光PCR引物設計 通過GadusmorhuaCoxI序列的比對分析，在序列的差異處設計大西洋鱈魚特異性引物(見圖1).上游引物序列為：5′-AATCTTAATACTTCTTTCTTTGAC-3′；下游引物序列為：5′-CTCAGACTATACCCATATACC-3′.

方框內示引物結合位點

1.3.3 引物特異性檢測 利用上述引物對大西洋鱈魚及其他樣品DNA進行實時熒光PCR擴增.熒光PCR反應體系為20 μL，包含SYBR Premix反應液10 μL、模板DNA 1 μL、引物各1 μL、滅菌雙蒸水7 μL.反應條件為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，40個循環.

1.3.4 靈敏度檢測 將大西洋鱈魚DNA梯度稀釋，制備成30，6，1.5，0.3，0.06，0.015 ng/μL 6個濃度梯度樣品，進行DNA濃度靈敏度實驗；將鯽魚肉粉與大西洋鱈肉粉混合配制成含大西洋鱈成分10%，1%，0.1%，0.01%，0.001%的質量分數梯度混合樣品，進行模擬樣品靈敏度實驗.

1.3.5 市售大西洋鱈魚制品的檢測 市售大西洋鱈魚制品主要為冷凍切片，購置大西洋鱈魚魚凍切片30份，大西洋鱈魚肝油5份，太平洋鱈魚冷凍切片15份，利用所建立的熒光PCR檢測方法測定其大西洋鱈魚成分.

2 結果與分析

2.1 DNA質量分析

利用超微量分光光度計測定樣品DNAD(260)值、D(280)值.所有提取的DNAD(260)/D(280)值均為1.8～2.0，表明所有抽提的DNA適用于PCR 檢測.

2.2 引物的特異性

提取大西洋鱈魚樣品和49份其他動植物樣品DNA，以100 ng DNA作為模板進行6次重復實驗，只有大西洋鱈魚樣本出現顯著擴增，6次平行反應的Ct(cycle threshold)值為23.216±0.113，5份大西洋鱈魚同屬鱈魚樣品和44種常見其他動植樣品均無明顯擴增曲線 (見圖2).

a 擴增曲線，b 熔解曲線.1大西洋鱈魚，2 阿拉斯加鱈魚，3 北太平洋無須鱈，4 綠青鱈，5 黑線鱈，

①7.5 ng/μL擴增結果；②1.5 ng/μL擴增結果；③0.3 ng/μL擴增結果；④0.06 ng/μL擴增結果；⑤0.012 ng/μL擴增結果；⑥空白對照

圖3大西洋鱈魚DNA濃度靈敏度檢測

2.3 靈敏度檢測

①10%擴增結果；②1%擴增結果；③0.1%擴增結果； ④0.01%擴增結果；⑤0.001%擴增結果；⑥空白對照 圖4 大西洋鱈魚模擬樣品靈敏度檢測

使用5倍梯度稀釋的大西洋鱈魚總DNA作為模板，進行熒光PCR檢測，當DNA質量濃度≥0.06 ng/μL時均可特異擴增(見圖3).由圖3可見，大西洋鱈魚基因組DNA檢測靈敏度可達0.06 ng/μL.將鯽魚肉粉與大西洋鱈魚肉粉配制成質量分數梯度混合樣品進行熒光PCR擴增，結果(見圖 4)顯示質量分數0.01%～10%的樣品均可出現穩定的擴增曲線，0.001%預混樣品未出現穩定的擴增曲線，表明模擬樣品靈敏度檢測可檢測出質量分數為0.01%的大西洋鱈魚肉粉.

2.4 市售大西洋鱈魚制品檢測結果

市售大西洋鱈魚制品冷凍切片檢測結果見表1.其中大西洋鱈魚切片均出現陽性結果，太平洋鱈魚切片均為陰性結果；精加工的大西洋鱈魚肝油未能出現特異性擴增曲線.

表1 市售大西洋鱈魚制品的源性檢測

3 討論

作為對摻假或以次充好進行監管的有效手段，熒光PCR檢測技術日益成熟，而國內目前尚未有使用熒光PCR技術對大西洋鱈魚成分進行定性檢測的報道，本研究屬國內首次.SYBR Green是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料；SYBR Green熒光PCR檢測方法相對于探針法需要額外添加引物，可以克服普通PCR法靈敏度不高等缺點，兼有簡單方便、靈敏度高、特異性好等優點.本研究所建立的大西洋鱈魚成分SYBR Green熒光PCR檢測方法具有良好的特異性；大西洋鱈魚基因組DNA檢測靈敏度可達0.06 ng/μL，模擬樣品靈敏度檢測可達質量分數僅為0.01%的大西洋鱈魚肉粉，可滿足日常檢測的要求.市售實際樣品的檢測結果表明，該方法具有很強的實用性.對于大西洋鱈魚肝油而言，由于在生產過程中需要經過一系列的復雜精細加工，DNA受到很大程度的破壞，所以該法不能用于鱈魚肝油中大西洋鱈魚成分的鑒定.但對于冷凍肉切片等未經深加工的樣品來說，可以準確地鑒定出大西洋鱈魚成分.

[1] 高天翔，張肖榮，王丹，等.幾種鱈魚的生物學初步研究[J].海洋湖沼通報，2003(1)：35-41.

[2] 李丞，劉芳，姜柏橋，等.大西洋鱈微衛星引物對太平洋鱈的適用性[J].水產科學，2010，29(4)：217-220.

[3] 田金輝.食品中動物源性成分定性鑒定方法研究[D].西安：西北農林科技大學，2011.

[4] 呂二盼.動物源性食品中各種動物源性肉及肉制品鑒別檢驗的研究[D].石家莊：河北農業大學，2012.

[5] 郭云霞，張舒亞，諶鴻超，等.SYBR Green 實時熒光PCR檢測食品中鯊魚源性成分真實性方法的建立[J].食品與生物技術學報，2012，31(12)：1673-1689.

[6] 齊興柱，駱劍，劉志亮，等.基于COI序列的DNA條形碼在中國海南裸鰭鱔屬魚類中的應用[J].熱帶生物學報，2010(1):321-326.

[7] 劉淑芳，陳亮亮，戴芳群，等.基于線粒體COI基因序列的DNA條形碼在石首魚科(Suciaenidae)魚類系統分類中的應用[J].海洋與湖澤，2010，41:223-232.

[8] 袁亞男，劉文忠.實時熒光定量PCR技術的類型、特點與應用[J].中國畜牧獸醫，2008，35(3): 27-30.

[9] 鐘江華，張光萍，柳小英.實時熒光定量PCR技術的研究進展與應用[J].氨基酸和生物資源，2011(2)：68-72.

[10] HERRERO B，VIEITES J M，ESPIEIRA M.Authentication of Atlantic salmon (Salmosalar) using real-time PCR [J].Food Chemistry，2011，127(3)：1268-1272.

[11] 朱德斌，邢曉波.實時熒光定量PCR方法快速檢測轉基因大豆[J].激光生物學報，2012(3)：279-282.

[12] AKASAKI T，YANAGIMOTO T，YAMAKAMI K，et al.Species identification and PCR-RFLP analysis of cytochrome b gene in cod fish (order Gadiformes) prod-ucts[J].Food Sci，2006，71(3):190-195.

(責任編輯：方林)

AnewSYBRGreenfluorescentPCRmethodforrapididentificationofGadusmorhuaanditsproducts

SUN Xiao-fei，JIANG Dan，WAN Chao，LIU Shu-yan，WU Bin

(Liaoning Entry-Exit Inspection and Qurantine Bureau，Dalian 116001，China)

Through Atlantic cod(Gadusmorhua) CoxI sequence comparison analysis，designed the Atlantic cod specific primers，establish the Atlantic cod SYBR Green fluorescence PCR qualitative detection method containing of specificity and sensitivity of detection assays.The results showed that only the Atlantic cod sample was significant amplification among 50 kinds of animal and plant sample.Six parallel reaction of Ct value was 23.216±0.113，5 samples of the Atlantic cod belong to cod and 44 kinds of common other move plant samples is negtive.Simulated sample sensitivity experiments showed that the primers could be detected 0.01% huso compent，the limit of detection was 0.06 ng per reaction.The further quantitative assay revealed that the method has high accuracy and sensitivity，and is able to detect Atlantic cod gradients.

Gadusmorhua；SYBR Green real-time fluorescence PCR；CoxⅠ

1000-1832(2017)03-0127-04

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2017.03.026

2016-08-16

國家質檢總局質檢公益性行業科研項目(201410059).

孫曉飛(1983—)，女，碩士，獸醫師；通訊作者：蔣丹(1978—)，女，博士，高級工程師，主要從事物種鑒定研究.

S 937 [學科代碼] 240·50

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