響應面法優化干蟾皮的提取工藝△

趙旭，汪坤，王楠斐

(河南省中醫院，河南 鄭州 450002)

·中藥工業·

響應面法優化干蟾皮的提取工藝△

趙旭*，汪坤，王楠斐

(河南省中醫院，河南 鄭州 450002)

目的：優選干蟾皮的提取工藝條件。方法：采用回流提取法提取干蟾皮，以華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的總量為考察指標，運用響應面法的設計，考察乙醇濃度、液料比、提取時間對提取工藝的影響。結果：優化的提取工藝條件為乙醇濃度為88.64%，液料比為12∶1，提取時間為1.49 h，在該優化條件下，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的總量為2.24 mg。結論：該優化工藝簡便、預測性良好，可以為干蟾皮的開發提供參考。

干蟾皮；響應面法；華蟾酥毒基；酯蟾毒配基

干蟾皮為蟾蜍科動物中華蟾蜍BufogargarizansCantor的干燥皮，具有清熱解毒、利水消腫的功能，適用于癰疽腫毒、疳積腹脹、瘰疬腫瘤等癥[1]。近年來干蟾皮用于多種癌癥或配合化療，可以減輕癌性疼痛，改善血常規，作用顯著。

研究表明，干蟾皮中主要含有蟾蜍二烯羥酸內酯類化合物及蟾毒色胺類及甾醇類，生理活性物質主要是蟾蜍毒素及水解產物蟾毒配基[2]。目前干蟾皮的主要提取方法有超聲提取法[3]、加熱回流提取法[4]、室溫浸漬法等，提取工藝的設計主要為單因素試驗法和正交設計試驗法[5]。響應面試驗法是目前中藥制劑生產工藝研究常用的方法之一，尤其適宜多指標、復雜成分提取工藝的優選[6-7]。本研究運用響應面法進行試驗設計，優選干蟾皮加熱回流提取工藝，為開發利用干蟾皮提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient-1260高效液相色譜儀；AE240型十萬分之一電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 試藥

干蟾皮購于亳州藥材市場，經河南省中醫院黃小敏副主任中藥師鑒定為蟾蜍科動物中華蟾蜍BufogargarizansCantor的干燥皮。華蟾酥毒基對照品、酯蟾毒配基對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110803-200605，110718-201108)；乙腈、甲醇為色譜純；水為娃哈哈飲用純凈水。

2 方法與結果

2.1 華蟾酥毒基、酯蟾毒配基含量測定方法

2.1.1 色譜條件 AgilentTC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈-0.5%磷酸二氫鉀溶液(50∶50)；檢測波長為293 nm；柱溫為40 ℃；流速為1 mL·min-1。理論塔板數以華蟾酥毒基計算>2000。標準品溶液、供試品溶液色譜圖如圖1。

注：A.標準品；B.供試品；1.華蟾酥毒基；2.酯蟾毒配基。圖1 干蟾皮HPLC圖

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取華蟾酥毒基、酯蟾毒配基標準品置于10 mL容量瓶中，加色譜甲醇定容，華蟾酥毒基質量濃度為53 μg·mL-1，酯蟾毒配基質量濃度為54 μg·mL-1。精密量取華蟾酥毒基對照品溶液4 mL，酯蟾毒配基對照品溶液1 mL，混勻即為混合標準品溶液。

2.1.3 供試品溶液配制 稱取干蟾皮2 g，按照正交試驗設計的條件加熱回流提取，濾紙過濾，收集提取液，水浴揮干后用色譜甲醇定容至50 mL容量瓶中，經0.22 μm微孔濾膜濾過，搖勻，即得。

2.1.4 方法學考察 標準曲線的制備：進樣華蟾酥毒基、酯蟾毒配基混合對照品2、4、6、8、10、12 μL，按2.1.1項下色譜條件測定，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得華蟾酥毒基回歸方程：Y=513.47X-0.060 7(r=0.099 9)，線性范圍為0.085～0.509 μg；酯蟾毒配基回歸方程：Y=422.91X-0.318 7(r=0.999 2)，線性范圍為0.022～0.130 9 μg。

精密度試驗：取華蟾酥毒基、酯蟾毒配基混合對照品溶液，重復進樣6次，每次10 μL，按2.1.1項下色譜條件測定，計算華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積的RSD分別為1.88%、1.07%，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：稱取干蟾皮2 g，按照供試品溶液制備方法制備樣品(10倍量90%乙醇提取2次，每次1.5 h)，分別放置0、2、4、6、8 h后進樣，進樣量10 μL，按2.1.1項下色譜條件測定，計算華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積的RSD分別為2.14%、2.37%，表明供試品溶液在8 h內穩定。

重復性試驗：稱取干蟾皮6份，每份2 g，按照供試品溶液制備方法制備樣品(10倍量90%乙醇提取2次，每次1.5 h)，分別進樣10 μL，按2.1.1項下色譜條件測定，計算華蟾酥毒基、酯蟾毒配基含量平均數分別為1.650、0.468 μg，總量平均數為2.12 μg，RSD值為2.96%，表明該方法重復性良好。

加樣回收率試驗：稱取干蟾皮6份，每份0.5 g，分別加入華蟾酥毒基對照品溶液(0.55 mg·mL-1)3 mL、酯蟾毒配基對照溶液(0.23 mg·mL-1)2 mL，按2.1.3項下方法制備供試品溶液，分別進樣10 μL，按2.1.1項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 華蟾酥毒基、酯蟾毒配基含量測定的加樣回收率試驗(n=6)

2.2 提取工藝優選

在預實驗的基礎上，固定提取次數為2次，選擇乙醇濃度、液料比、提取時間為自變量，以華蟾酥毒基、酯蟾毒配基總量為響應值，設計三因素三水平中心復合試驗，因素水平表見表2。稱取干蟾皮，按照設計方案提取，按2.1.3項下制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件測定華蟾酥毒基、酯蟾毒配基含量，試驗安排及結果見表3。采用Design Expert 8.06軟件對所得的數據進行回歸分析，結果見表4。

表2 提取工藝中心復合試驗因素水平

表3 響應面試驗方案及分析結果

經Design Expert 8.06軟件擬合得總評分Y對提取時間、提取次數、加水量的二次多項回歸方程：Y=2.14-0.078A+0.016B+0.066C-0.078AB-0.048AC-0.045BC-0.21A2-0.202+0.020C2。

由表4可知模型回歸P值為0.006 7，說明模型回歸顯著可靠；失擬誤差P值為0.200 2>0.05，失擬度不明顯，說明該方程擬合度較高，該模型可以預測干蟾皮提取工藝過程。

表4 回歸系數的顯著性檢驗

乙醇濃度、液料比、乙醇濃度的平方、提取時間的平方對綜合評分的的影響較顯著(P<0.05)，在三個因素之間，乙醇濃度對試驗結果的影響最大。

根據二次多項式方程，分別繪制各指標與響應值交互項的響應曲面圖，用來確定各因素對干蟾皮提取工藝的影響，結果見圖2～4。

圖2 提取時間與乙醇濃度交互作用的響應面圖

圖3 液料比與乙醇濃度交互作用的響應面圖

圖4 液料比與提取時間交互作用的響應面圖

通過Design Expert 8.06軟件計算并分析得到的各因素的最優條件：88.64%的乙醇提取2次，每次1.49 h，液料比為12∶1，預測華蟾酥毒基、酯蟾毒配基含量總量為2.24 mg。

2.3 驗證性試驗

取同一批干蟾皮，精密稱取3份，每份2 g，按照優選的提取工藝進行提取，計算華蟾酥毒基、酯蟾毒配基平均含量總量為2.28 mg，RSD值為2.13%，與預測值偏差較小，說明優選的提取工藝穩定可靠。

3 討論

干蟾皮具有明確的抗癌作用，對其藥效成分進行有效提取并開發利用具有實用價值。響應面法目前廣泛應用于中藥提取工藝研究[8-10]，其分析方法直觀、精密度高、預測性好。

本研究在預實驗的基礎上首先固定提取次數為2次，通過響應面法分析乙醇濃度、提取時間、液料比3個因素對干蟾皮提取工藝的影響，模擬的二

次項方程通過回歸和檢驗分析都具有很好的擬合性和有效性，表明此方程具有可預測性，最終確定干蟾皮提取工藝的條件為88.64%的乙醇提取2次，每次1.49 h，液料比為12∶1。該研究可以為干蟾皮的提取開發提供參考。

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OptimizationofExtractionCraftBufoCoriumbyUsingBox-BehnkenResponseSurfaceMethod

ZHAOXu*，WANGKun，WANGNanfei

(HeNanProvinceHospitalofTCM，Zhengzhou450002，China)

Objective：To optimize the extraction process of craft bufo.Methods：The refluxing process was applied，the amount of cinobufagin and resibufogenin was used as response value，box-Behnken response surface method was employed to investigate the influence of ethanol concentration，extraction time and the amount of alcohol added on the extraction process of craft bufo.Results：The optimized extraction technology was：extracted 2 times with 12 times the amount of 88.64% ethanol；1.49 hours per time.Under the optimized conditions，the total amount of cinobufagin and resibufogenin was 2.24 mg.Conclusion：The optimized extraction process is simple and predictable，can provide a reference basis for production.

Bufocurium；Box-Behnken Response Surface Method；cinobufagin；resibufogenin

河南省科技公共計劃項目(132102310243)

] 趙旭，副主任中藥師，研究方向：醫院制劑研究；Tel：(0371)60908883，E-mail：13592533250@139.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.020

2016-04-05)

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