響應面法優(yōu)化蓮子蛋白提取工藝研究△

孫天霞，尹翌秋，張鵬飛，王敏，張麗軒，趙雨，王思明*

(1.長春中醫(yī)藥大學 中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心，吉林 長春 130117；2.長春金賽藥業(yè)有限責任公司，吉林 長春 130012)

·中藥工業(yè)·

響應面法優(yōu)化蓮子蛋白提取工藝研究△

孫天霞1，尹翌秋2，張鵬飛1，王敏1，張麗軒1，趙雨1，王思明1*

(1.長春中醫(yī)藥大學 中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心，吉林 長春 130117；2.長春金賽藥業(yè)有限責任公司，吉林 長春 130012)

目的：研究蓮子蛋白質(zhì)水提取的最佳條件。方法：在單因素試驗分析的基礎上，采用合理的實驗設計方案，通過響應面法優(yōu)化蓮子蛋白的提取條件。結(jié)果：提取蓮子蛋白的最佳工藝參數(shù)為提取pH值8.0，料液比1∶15，提取時間7 h，蛋白提取率為14.53%。結(jié)論：響應面法優(yōu)化的蓮子蛋白提取條件簡便易行，準確性和重現(xiàn)性好，具有實際應用價值。

蓮子；蛋白質(zhì)；提取條件；響應面法

蓮子又名水之丹，是我國特有的種質(zhì)資源，屬睡蓮科多年水生草本植物蓮的成熟種子。據(jù)《本草綱目》記載[1]，蓮子有“補中養(yǎng)神，止渴去熱，安心止痢，交心腎，固精氣，強筋骨，補虛損，利耳目，除寒濕”等功能。現(xiàn)代研究表明[2]，蓮子中蛋白質(zhì)含量高，是較理想的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，其中氨基酸數(shù)量和比例較平衡，蛋氨酸達到了世界衛(wèi)生組織規(guī)定標準，可有效補充豆類蛋白中蛋氨酸的不足。同時蓮子又富含賴氨酸，可彌補谷類蛋白質(zhì)中賴氨酸的不足，大大提高了蓮子的營養(yǎng)價值。

然而迄今為止，市場上以蓮子為主要成分的產(chǎn)品比較單一，蓮子作為營養(yǎng)珍品長期以來僅停留在糖水蓮子、制成蜜餞等簡單工藝加工上，未見與蓮子蛋白質(zhì)相關(guān)的保健食品[3]。其主要原因是蓮子蛋白質(zhì)的提取率普遍偏低，嚴重制約了對其系統(tǒng)研究和開發(fā)。

響應面分析法是一種綜合實驗設計和數(shù)學模型優(yōu)化的分析方法，采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計的工具，將多因子實驗中的因素與指標之間的相互關(guān)系用多項式近似擬合，給出直觀等高線圖和三維立體圖，依此可對函數(shù)的響應面和等高線進行分析，可研究因子與響應值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并可進行優(yōu)化[4-6]。與目前廣泛使用的“正交試驗設計法”相比，其具有實驗周期短、求得的回歸方程精度高、預測性能好，能研究幾種因素間交互作用、能設計最優(yōu)組合，和計算響應目標的最優(yōu)值等優(yōu)點[7]。

本研究針對蓮子蛋白提取率低的問題，結(jié)合響應面分析法，著重對蓮子蛋白質(zhì)的提取方法進行實驗，通過單因素試驗確定各影響因子，優(yōu)化了蓮子蛋白質(zhì)的提取條件，為將蓮子用于生產(chǎn)蓮子蛋白粉或其他含蓮蛋白保健品及蓮子蛋白本身的進一步研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

pH計FE20(美國梅特勒-托利多公司)；冷凍離心機Gentrifuge 5804R(德國Eppendorf公司)；低溫真空冷凍干燥機LL3000(德國Heto)；Infinite M200Pro多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)；電子天平AL204(美國梅特勒-托利多公司)。

1.2 試藥

蓮子購于宏檢大藥房；Bradford蛋白定量試劑盒購于天根；磷酸鹽緩沖液(PBS)由實驗室配置；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉(北京化工廠)。

2 方法

2.1 蛋白質(zhì)提取及含量測定

蓮子經(jīng)高速粉碎機粉碎，精密稱取1 g蓮子粉置于圓底燒瓶中，按照各項預設條件(料液比、pH值、提取時間、提取次數(shù))進行水提，以6000 r·min-1離心10 min，取上清液，凍干(濃縮)后稱重，取凍干后的樣品，精密稱取1 mg，溶于1 mL水中，配置成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液。

采用考馬斯亮藍G250法[8]，分別準確吸取1 mg·mL-1的牛血清蛋白0、1、2、3、4、5、6 μL，分別加入96孔板中，另加入PBS緩沖液15、14、13、12、11、10、9 μL，再各加入285 μL考馬斯亮藍G250，震蕩混勻，室溫放置6 min，于595 nm處測其吸光度。以蛋白濃度(mg·mL-1)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制出標準曲線。

樣品中蛋白質(zhì)濃度的測定：取15 μL不同實驗條件下所提取的蛋白溶液，加入285 μL考馬斯亮藍G250，在595 nm處測其吸光度，從而計算出總蛋白的提取率。

2.2 提取條件單因素試驗設計

2.2.1 提取時間對蛋白提取率的影響 分別精密稱取蓮子粉1 g于100 mL容量瓶中，以料液比(W/V)1∶25，pH 7.0，提取時間分別為1.0、2.0、4.0、7.0、10.0、24.0 h，攪拌提取[9]。

2.2.2 pH值對蛋白提取率的影響 分別精密稱取蓮子粉1 g于100 mL容量瓶中，料液比(W/V)1∶25，用HCl、NaOH溶液調(diào)節(jié)提取液pH值，分別取pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，攪拌提取5.0 h[10]。

2.2.3 料液比對蛋白提取率的影響 分別精密稱取蓮子粉1 g于100 mL容量瓶中，以料液比(W/V)1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，pH為7.0，攪拌提取5.0 h[11]。

2.2.4 提取次數(shù)對蛋白提取率的影響 別精密稱取蓮子粉1 g于100 mL容量瓶中，料液比(W/V)1∶25，pH 7.0，攪拌提取5.0 h，分別提取1、2、3、4次，將提取液合并[12]。

2.2.5 蓮子蛋白等電點對提取率的影響 將蓮子蛋白提取液用0.01 mol·L-1鹽酸調(diào)pH值分別為3、3.5、4、4.5、5，使蛋白質(zhì)沉淀，離心后取上清液進行比色測定，吸光度最小的即為等電點。

2.3 響應面法對蓮子蛋白提取條件進行優(yōu)化

綜合單因素試驗結(jié)果，采用Design-Expert.8.0軟件中的Box-Behnken[13]中心組合實驗設計原理，對料液比、提取時間、pH值3個影響蛋白質(zhì)提取效果的因素進行考察，以蓮子蛋白質(zhì)提取率為響應值。共17個試驗點，其中12個為析因子，5個為中心試驗，用以評估誤差。設計三因素三水平的響應分析試驗，建立二次多項式回歸模型，各因素水平及編碼見表1。

表1 Box-Behnken因素水平表

3 結(jié)果與分析

3.1 標準曲線的繪制

以牛血清蛋白濃度(mg·mL-1)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制出標準曲線，得回歸方程：Y=1.649X+0.413，r=0.995 0，式中Y為吸光度，X為蛋白濃度(mg·mL-1)。

3.2 蓮子蛋白提取單因素試驗

3.2.1 提取時間對提取率的影響 固定pH值、料液比、提取次數(shù)等影響因素，在不同提取時間下研究其對蓮子蛋白提取率的影響。見圖1。隨著提取時間的延長，蛋白提取率在7 h前增加較為明顯，7 h后急劇下降，從蛋白穩(wěn)定性考慮，確定最佳蓮子蛋白提取時間為7 h。

注：提取時間從左到右依次為1、2、4、7、10、24 h。圖1 提取時間與提取率的關(guān)系

3.2.2 料液比對提取率的影響 固定提取時間、pH值、提取次數(shù)等因素，研究料液比對蓮子蛋白提取率的影響。見圖2。料液比為1∶15時，蓮子蛋白的提取率最大，料液比從1∶5到1∶15蓮子蛋白提取率顯著增加，隨著其提取液體積的逐漸增大，蓮子蛋白提取率逐漸下降。同時大量提取液在后續(xù)工序中需經(jīng)濃縮，從提取效率和節(jié)約資源綜合來考慮，確定蓮子蛋白提取的最佳料液比為1∶15。

注：液料比從左到右依次為5、10、15、20、25。圖2 液料比與提取率的關(guān)系

3.2.3 pH值對提取率的影響 固定提取時間、料液比、提取次數(shù)等因素，研究pH值對蓮子蛋白提取率的影響。從圖3可以看出，隨著pH值在5.0到8.0，提取率明顯上升，8.0之后緩慢下降。預測該pH值與蓮子蛋白的等電點較接近。選擇最佳提取pH值為8.0。

注：pH值從左到右依次為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。圖3 pH值與提取率的關(guān)系

3.2.4提取次數(shù)對提取率的影響 固定提取時間、料液比、pH值等因素，研究提取次數(shù)對蓮子蛋白提取率的影響。由圖4所示，隨著提取次數(shù)的增加，蓮子蛋白提取率逐漸下降，從工序的角度及成本節(jié)約考慮，將其提取次數(shù)固定為一次。

注：提取次數(shù)從左到右依次為1、2、3、4。圖4 提取次數(shù)與提取率的關(guān)系

3.2.5 蓮子蛋白等電點對提取率的影響 固定pH值、料液比、pH值、提取次數(shù)等因素，研究蓮子蛋白等電點對蓮子蛋白提取率的影響。pH值在3.0到4.5區(qū)間明顯下降，在4.5時提取率最低，之后蛋白提取率有明顯上升趨勢。因此判斷pH值4.5位蓮子蛋白等電點。

注：pH值從左到右依次為3、3.5、4、4.5、5。圖5 蓮子蛋白等電點與提取率的關(guān)系

3.3 提取條件的響應面實驗結(jié)果與分析

在上述單因素試驗的基礎上，Box-Behnken中心組合實驗設計原理，對蓮子蛋白提取工藝中的pH值、料液比、提取時間3個因素做進一步優(yōu)化。以A=pH、B=料液比、C=提取時間為自變量，蓮子蛋白的提取率為響應值R，3因素3水平的響應面分析方案及結(jié)果見表2[14]。

表2 響應面分析方案及結(jié)果

表3 蓮子蛋白提取回歸分析

注：*表示對結(jié)果影響顯著(P<0.05)；**表示對結(jié)果影響極顯著(P<0.01)。

表4 回歸模型方差分析

按照Box-behnken Design(BBD)實驗設計方法的統(tǒng)計學要求，對提取率的響應面優(yōu)化試驗結(jié)果進行多元非線性回歸分析，得到料液比、pH、提取時間對蓮子蛋白提取率(Y)的擬合方程：Y=14.46-0.015A-0.27B+0.41C-0.26AB+1.14AC+0.24BC-1.65A2-1.64B2-0.87C2。表3顯示，模型的P<0.005，表明本實驗所采用的二次模型極顯著，可用來進行響應值(蓮子蛋白提取率)的預測[15]。由F檢驗來判定，概率P(F>Fα)的值越小，則相應變量的顯著程度越高。在二次項中，PA，PB小于0.01，說明pH值和料液比對提取率(響應值)的影響極顯著，而PC小于0.05，說明提取時間對提取率影響顯著。交互項中，PAC小于0.05，說明pH值與料液比交互作用對提取率的影響顯著。其他各個因素作用不顯著。由表4可知，蓮子蛋白提取率的負相關(guān)系數(shù)r為0.946 7，表明該回歸模型擬合情況良好，回歸方程代表性較好，可以準確預測實際情況；校正系數(shù)RAdj=0.878 2，表明87.82%的實驗數(shù)據(jù)的變異性可用該模型來解釋；變異系數(shù)CV=4.33%，變異系數(shù)越低說明本次實驗的可信度與精密度越高；精密度(Adeq Precision)實驗中此值大于4視為合理，本次實驗精密度為9.86，表明該模型精密度良好。綜上所述，該模型可以較好地反應響應值的變化。根據(jù)回歸分析結(jié)果作出相應的響應曲面圖進一步直觀地確認料液比、pH值、提取時間三因素的交互作用對蓮子蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖3～8。

利用Design-Expert 8.0軟件進行擬合，進一步直觀了解料液比、pH值、提取時間之間兩兩交互作用對蓮子蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖6～8。交互效應的強弱根據(jù)等高線的形狀可反映，圓形表示兩因素交互作用較弱，而橢圓形則與之相反[16]。

對圖6～8進行分析可得出，提取時間和pH值對蓮子蛋白提取率的影響較為顯著。由高線圖可知，pH值應選擇在7.5～8.5，料液比應該選擇在1∶12～1∶17；提取時間應在5.5～10 h。以上響應面圖和等高線圖的分析結(jié)果也進一步驗證了通過單因素分析而獲得的最佳提取工藝參數(shù)。

圖6 pH與液料比的交互作用響應面及等高線

圖7 pH與提取時間的交互作用響應面及等高線

圖8 液料比與提取時間的交互作用響應面及等高線

通過模型分析[17]，響應值R取最大值時，提取條件的取值：料液比為1∶15，提取時間為7 h，提取pH值為8.0，蓮子蛋白理論提取率最大。在上述提取條件下，通過進一步實驗對模型的可靠性進行驗證[18]，重復進行3次實驗，得到的蓮子蛋白的平均提取率為14.53%，與預測值14.46%的誤差為0.54%，說明該回歸方程可以較好地預測蓮子蛋白的提取率。

4 結(jié)論

蓮子的藥用食用價值很大，但是現(xiàn)在還沒有得到完全開發(fā)，無論是從使用狀況方面還是經(jīng)濟效益方面來看都是沒有益處的。以前經(jīng)常用的方法是正交試驗找到最佳提取條件，但是正交試驗有很多缺點，可能會使實驗結(jié)果不準確。而響應面法就可以很大程度地彌補這些缺點。

本研究以蓮子蛋白提取率為考察指標，選取料液比、提取時間、pH值、提取次數(shù)四個因素，考察其對蛋白提取率的影響，在單因素試驗基礎上，利用響應面法建立料液比、提取時間、pH值與總蛋白提取率之間的數(shù)學回歸模型，并結(jié)合相關(guān)的方差分析，探討了關(guān)鍵因素及其相互作用，并結(jié)合Design-Expert.8.0軟件中的Box-Behnken進行響應試驗分析。

回歸分析和驗證實驗結(jié)果表明，此提取方法簡單、合理、可行。得到蓮子蛋白提取的最佳條件：料液比 1∶15，提取時間7 h，提取pH值8.0，蛋白的實際提取率為14.53%。

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OptimizationofExtractionProcessofProteinfromLotusSeedbyResponseSurfaceMethodology

SUNTianxia1，YINYiqiu2，ZHANGPengfei1，WANGMin1，ZHANGLixuan1，ZHAOYu1，WANGSiming1*

(1.TraditionalChineseMedicineandBiotechnologyResearchandDevelopmentCenter，ChangchunUniversityofTraditionalChineseMedicine，JilinProvince，Changchun130117，China； 2.GenSciencePharmaceuticalsCo.，Ltd.JilinProvince，Changchun130012，China)

Objective：To optimize the extraction process for protein from lotus seed.Methods：Based on the single factor analysis，the lotus seed protein extraction conditions were optimized by the response surface method.Results：The results showed that the optima extraction conditions were as follows：initial pH 8.0，solid-liquid ratio 1∶15，extraction time 7 h，which resulted in in an extraction yield of 14.53%.Conclusion：By using the response surface methodology extraction technology，the extraction process was easy to operate and accurate and good reproducible and has a practical application value.

Lotus seed；protein；extraction condition；extraction technology

吉林省中藥生物技術(shù)重點實驗室(20140622003JC)

] 王思明，醫(yī)學碩士，研究方向：中藥蛋白質(zhì)；Email：lwsm126030@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.019

2016-07-12)

*[