玉女煎對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用及機(jī)制研究△

雷莉妍，王瑞成，謝培，張丹丹，唐志書(shū)，宋忠興

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心 陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712083；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；3.陜西中醫(yī)藥 大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

·基礎(chǔ)研究·

玉女煎對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用及機(jī)制研究△

雷莉妍1*，王瑞成2，謝培1，張丹丹3，唐志書(shū)1，宋忠興1

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心 陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712083；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；3.陜西中醫(yī)藥 大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

目的：觀(guān)察玉女煎對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的干預(yù)作用及可能的作用機(jī)制。方法：在整體動(dòng)物水平，采用完全弗氏佐劑誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎模型，大鼠隨機(jī)分為正常組、關(guān)節(jié)炎模型組、雷公藤多苷陽(yáng)性對(duì)照組、YNJ 高劑量組(6.1 g生藥·kg-1)、YNJ中劑量組(3 g生藥·kg-1)、YNJ 低劑量組(1.5 g生藥·kg-1)，分別測(cè)定大鼠的體質(zhì)量、足腫脹度，并通過(guò)ELISA法檢測(cè)血清中的IL-1、IL-6、TNF-α及PGE2水平。在細(xì)胞水平，采用IL-1誘導(dǎo)人成纖維樣滑膜細(xì)胞HFLS炎癥模型，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-6及TNF-α生成量。結(jié)果：玉女煎能有效地恢復(fù)炎癥誘導(dǎo)的體質(zhì)量降低，改善足腫脹程度，在動(dòng)物和細(xì)胞水平均能顯著抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。結(jié)論：玉女煎具有顯著的抗大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎活性，可能通過(guò)抑制炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮作用。

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；佐劑性關(guān)節(jié)炎；玉女煎；抗炎；炎癥因子

玉女煎系載于《景岳全書(shū)》的一首古方，由生石膏、熟地黃、知母、麥冬、牛膝5味中藥組成，具有清胃瀉火、滋陰增液的功能，在臨床上多用于治療牙周炎、口腔潰瘍、糖尿病等炎癥相關(guān)疾病。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，加減玉女煎對(duì)實(shí)驗(yàn)性心室重構(gòu)和實(shí)驗(yàn)性甲狀腺功能亢進(jìn)有顯著的改善作用[1-2]，加味玉女煎對(duì)退行性膝關(guān)節(jié)炎也有顯著的治療效果[3]。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫障礙引起的慢性炎癥[4]，佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)是一種與人類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理極為相似的一種免疫炎癥模型[5]。本實(shí)驗(yàn)擬采用AA大鼠模型，觀(guān)察玉女煎對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的影響，并通過(guò)成纖維樣滑膜細(xì)胞炎癥模型探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003。動(dòng)物購(gòu)回后，正常喂養(yǎng)一周以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件。在此期間，所有大鼠可自由進(jìn)食及飲水。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照當(dāng)?shù)貏?dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求進(jìn)行。

1.2 主要材料及試劑

石膏、知母、熟地黃、牛膝及麥冬(陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司)；雷公藤多苷片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，批號(hào)：150308)；完全弗氏佐劑(美國(guó)Sigma公司)；大鼠源IL-1、IL-6、TNF-α和PGE2、ELISA檢測(cè)試劑盒，人源IL-6、TNF-α的ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)ADL公司；人成纖維樣滑膜細(xì)胞(美國(guó)ATCC)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 主要儀器

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek)；低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))；循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；大小鼠足趾容積測(cè)量?jī)x(美國(guó)IITC公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))；調(diào)溫型電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)。

2 方法

2.1 玉女煎干粉的制備

分別精確稱(chēng)取15 g 生石膏，30 g熟地黃，6 g麥冬，5 g知母，5 g牛膝，加10倍水浸泡40 min，加熱回流提取1 h，過(guò)濾，濾渣再加8倍量水加熱回流提取1 h，再次過(guò)濾，合并兩次濾液并進(jìn)行濃縮，最后經(jīng)冷凍干燥后制成干粉，備用。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的建立 SD大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件1周后，隨機(jī)抽取10只標(biāo)記為正常對(duì)照組，左后足趾皮內(nèi)注射0.1 mL 0.9%氯化鈉溶液。另取50只大鼠，左后足趾皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑(Freund’s Complete Adjuvent，F(xiàn)CA)0.1 mL誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎。

2.2.2 給藥方案 經(jīng)完全弗氏佐劑處理的大鼠隨機(jī)分為5組，即AA模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、YNJ 高劑量組(6.1 g生藥·kg-1，根據(jù)日處方量和大鼠與人體表比換算法計(jì)算劑量，相當(dāng)于4.36 g干粉·kg-1)，YNJ 中劑量組(3 g生藥·kg-1，相當(dāng)于2.14 g干粉·kg-1)，YNJ 低劑量組(1.5 g生藥·kg-1，相當(dāng)于1.07 g干粉·kg-1)，每組10只。從致炎后第12 d開(kāi)始，各組大鼠灌胃給藥，正常組和模型組給相同體積的純凈水，陽(yáng)性藥物組給予30 mg·kg-1的雷公藤多苷，治療組給予不同劑量的玉女煎。

2.2.3 觀(guān)察指標(biāo)

2.2.3.1 體質(zhì)量 在致炎前測(cè)量大鼠體重，并在A(yíng)A大鼠出現(xiàn)繼發(fā)性足腫反應(yīng)時(shí)，每4天測(cè)量1次體質(zhì)量，觀(guān)察玉女煎對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體質(zhì)量的影響。

2.2.3.2 腫脹度測(cè)量 在A(yíng)A大鼠出現(xiàn)繼發(fā)性足腫脹反應(yīng)時(shí)，采用大鼠足腫脹儀每4天測(cè)量1次右后足踝關(guān)節(jié)標(biāo)記線(xiàn)下的足趾體積，以該值與致炎前同側(cè)足趾體積差值作為評(píng)價(jià)足腫脹程度的指標(biāo)。

2.2.3.3 血清炎癥指標(biāo) 在第28 d時(shí)，水合氯醛麻醉大鼠，于腹腔靜脈取血，并3000 r·min-1離心10 min，取上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中的IL-1、IL-6、TNF-α及PGE2水平。

2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人成纖維樣滑膜細(xì)胞HFLS培養(yǎng)在DMEM高糖培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清，100 U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)中，于37 ℃ CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合時(shí)，用含血清的新鮮培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，并以1∶2的密度進(jìn)行傳代。

2.3.2 MTT實(shí)驗(yàn) HFLS細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)基，用不同濃度的玉女煎處理細(xì)胞24 h。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入15 μL的MTT。培養(yǎng)結(jié)束后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的DMSO，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度值，選擇對(duì)細(xì)胞生存無(wú)影響的藥物濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 IL-1誘導(dǎo)HFLS細(xì)胞炎癥模型 HFLS細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，細(xì)胞完全貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，用2.0 ng·mL-1IL-1和不同濃度的玉女煎處理細(xì)胞24 h。取上清液，ELISA法檢測(cè)上清液中IL-6和TNF-α含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 玉女煎干粉的制備及分析

玉女煎原方生藥總量為61 g，經(jīng)提取干燥后得43.6 g干粉，并通過(guò)HPLC研究了玉女煎提取物的指紋圖譜[6]，確認(rèn)了5個(gè)代表性化學(xué)成分，分別是5-羥甲基糠醛、芒果苷、毛蕊花糖苷、蛻皮甾酮、甲基麥冬二氫高異黃酮A。

3.2 玉女煎對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體質(zhì)量的影響

AA大鼠由于繼發(fā)性的炎癥，導(dǎo)致倦怠、食欲下降，體質(zhì)量也會(huì)發(fā)生變化。如圖1所示，與正常組相比，AA模型大鼠的體質(zhì)量下降，在第16天時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。YNJ 高劑量、中劑量組及陽(yáng)性藥物雷公藤多苷治療組可改善體質(zhì)量的下降狀況，第28天時(shí)YNJ 高劑量組與模型組體質(zhì)量相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n=10；下同。圖1 玉女煎對(duì)AA大鼠體質(zhì)量的影響

3.3 玉女煎對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠繼發(fā)性足腫脹的影響

完全佐劑關(guān)節(jié)炎模型在造模后第12 d會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性足腫脹。如圖2所示，與正常組相比，AA模型組大鼠第12 d右后足趾出現(xiàn)顯著的繼發(fā)性足腫脹(P<0.01)。YNJ高劑量組可明顯抑制佐劑誘導(dǎo)的繼發(fā)性足腫脹，在第24天時(shí)與模型組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

圖2 玉女煎對(duì)AA大鼠繼發(fā)性足腫脹的影響

3.4 玉女煎對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清相關(guān)炎癥指標(biāo)的影響

與正常組相比，AA 模型組大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α和PGE2 的含量均顯著提高，見(jiàn)圖3。玉女煎高劑量治療組大鼠血清中各炎癥指標(biāo)水平均出現(xiàn)降低，與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.5 玉女煎對(duì)IL-1誘導(dǎo)HFLS細(xì)胞TNF-α及IL-6生成的影響

我們首先通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)研究玉女煎對(duì)HFLS細(xì)胞存活的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)玉女煎給藥濃度高于6 mg干粉·mL-1(相當(dāng)于8.39 mg生藥·mL-1)時(shí)，表現(xiàn)出一定的細(xì)胞增殖活性。因此，我們選擇無(wú)細(xì)胞增殖活性的2 mg干粉·mL-1(相當(dāng)于2.80 mg生藥·mL-1)、4 mg干粉·mL-1(相當(dāng)于5.60 mg生藥·mL-1)和6 mg干粉·mL-1(相當(dāng)于8.40 mg生藥·mL-1)3個(gè)質(zhì)量濃度研究玉女煎對(duì)IL-1誘導(dǎo)的HFLS人滑膜細(xì)胞TNF-α及IL-6的影響。研究結(jié)果顯示，玉女煎能以質(zhì)量濃度依賴(lài)的方式顯著抑制IL-1誘導(dǎo)的TNF-α及IL-6生成(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

4 討論

由于病機(jī)不明確，且臨床表現(xiàn)復(fù)雜，目前對(duì)于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎尚無(wú)理想的治療方案。AA是一種免疫制劑誘導(dǎo)的免疫亢進(jìn)性炎癥模型，目前常作為人類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

AA大鼠由于倦怠、食欲下降等會(huì)導(dǎo)致體質(zhì)量減輕。本研究顯示玉女煎可顯著改善炎癥誘導(dǎo)的AA大鼠體重降低。完全佐劑誘導(dǎo)的大鼠足腫脹在12 d時(shí)會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性腫脹。結(jié)果顯示，玉女煎對(duì)繼發(fā)性足腫脹具有很好的抑制作用，越來(lái)越多的研究顯示細(xì)胞因子在該疾病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。IL-1能刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體量增加，同時(shí)還能誘導(dǎo)PGE2 膠原酶的產(chǎn)生[7]；TNF-α是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)鍵的炎癥細(xì)胞因子，可通過(guò)刺激蛋白多糖的吸收并抑制其合成進(jìn)而促使

注：A.血清中IL-1質(zhì)量濃度；B.血清中IL-6質(zhì)量濃度；C.血清中TNF-α質(zhì)量濃度；D.血清中PGE2質(zhì)量濃度。圖3 玉女煎對(duì)AA大鼠血清炎癥因子的影響

注：A.細(xì)胞上清液中TNF-α質(zhì)量濃度；B.細(xì)胞上清液中IL-6質(zhì)量濃度。圖4 玉女煎對(duì)IL-1誘導(dǎo)HFLS細(xì)胞炎癥因子分泌的影響

軟骨降解[8]；IL-1和TNF-α可誘導(dǎo)IL-6分泌，而IL-6能刺激活化的B細(xì)胞增殖[9]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，AA模型組大鼠血清中的炎癥細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TNF-α及PGE2水平均顯著升高，玉女煎可降低完全佐劑誘導(dǎo)的炎癥指標(biāo)，改善炎癥狀況。

隨后，我們用成纖維樣滑膜細(xì)胞HFLS對(duì)玉女煎抗炎的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。本實(shí)驗(yàn)采用IL-1誘導(dǎo)HFLS炎癥，并對(duì)TNF-α和IL-6水平進(jìn)行了檢測(cè)。玉女煎能顯著抑制IL-1誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6生成。IL-6、TNF-α及IL-1等都是NF-κB的重要下游基因。這進(jìn)一步說(shuō)明，玉女煎可能通過(guò)抑制炎癥因子的分泌發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，玉女煎對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎有一定的治療作用，該作用可能是通過(guò)抑制相關(guān)炎癥因子分泌發(fā)揮作用，本結(jié)果將為玉女煎治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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StudyonEffectandMechanismofYunüjianonAdjuvantArthritisRat

LEILiyan1*，WANGRuicheng2，XIEPei1，ZHANGDandan3，TANGZhishu1，SONGZhongxing1

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，ShaanxiprovincekeylaboratoryofnewdrugsandChinesemedicinefoundationresearch，Xianyang712083，China； 2.TheAffiliatedHospitaltoShaanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712000，China； 3.SchoolofPharmacy，ShaanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712000，China)

Objective：To investigate the effect and mechanism of Yunüjian on the arthritic rat.Methods：The adjuvant arthritis rat model was established by injecting the complete Frund’s adjuvant into the subcutis of their left rear paws.Rats were randomly divided into control group，adjuvant arthritis(AA)model group，tripterygium glycosides group，Yunüjian high-dose(6.1 g herbs·kg-1)group，Yunüjian middle-dose(3 g herbs·kg-1)group，and Yunüjian low-dose(1.5 g herbs·kg-1)group.The volume of paw swelling was detected，and the serum levels of IL-1，IL-6，TNF-α and PGE2 were measured by ELISA.HFLS cells were treated by IL-1，generation of IL-6 and TNF-α was detected by ELISA assay.Results：Yunüjian remarkably inhibited the reduction of body weight，decreased the swelling degree of the rat paws，and decreased the concentration of inflammatory factor.Conclusion：Yunüjian has a notable anti-inflammation activity，possibly through inhibition the expression of inflammatory factors.

Rheumatoid arthritis；adjuvant arthritis；Yunüjian；anti-inflammatory effect；inflammatory factor

陜西中醫(yī)藥大學(xué)重點(diǎn)培育項(xiàng)目(2015PY08)；陜西省中醫(yī)管理局中醫(yī)藥科研基金項(xiàng)目(15-ZY009)；陜西省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2012KTC-20)；陜西省科技資源開(kāi)放共享平臺(tái)項(xiàng)目(2015FWPT-01)

] 雷莉妍，博士，講師，研究方向：中藥活性成分篩選與作用機(jī)理研究；E-mail：liyanlei-2005@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.007

2016-06-12)

*[