馬齒莧水提物不同組分促進小鼠小腸推進活性篩選△

袁淑青，吳春珍，胡高達，張奇，劉英

(國藥集團 國藥健康產業研究院有限公司，上海 201203)

馬齒莧水提物不同組分促進小鼠小腸推進活性篩選△

袁淑青，吳春珍，胡高達，張奇，劉英*

(國藥集團 國藥健康產業研究院有限公司，上海 201203)

目的：為了揭示馬齒莧藥材中具有潤腸通便功能的藥效物質。方法：采用水提醇沉的方法制備馬齒莧總多糖和生物堿，并使用三氯甲烷和正丁醇的混合液脫除多糖中蛋白質得到脫蛋白多糖，再使用AB-8大孔吸附樹脂分離上清液中低極性成分和高極性成分。制備洛哌丁胺致腸蠕動抑制模型小鼠，采用碳墨推進法，通過測定馬齒莧各活性組分模型小鼠小腸推進的百分率及脫蛋白多糖正常小鼠小腸推進百分率進行篩選和評價。結果：制備得到馬齒莧多糖、馬齒莧脫蛋白多糖、馬齒莧生物堿、水提醇沉上清液中低極性成分和高級性成分；小鼠小腸推進實驗結果顯示，馬齒莧多糖及脫蛋白多糖對腸蠕動抑制模型小鼠的小腸推進有促進作用，而且馬齒莧脫蛋白多糖對正常小鼠、模型小鼠小腸推進均有促進作用，且呈良好的量效關系。結論：馬齒莧藥材中具有潤腸通便功能的藥效物質為多糖成分。

齒莧；活性組分；脫蛋白多糖；小腸推進

《中藥大辭典》中記載[1]，馬齒莧PortulacaoleraceaL.為馬齒莧科馬齒莧屬植物馬齒莧的全草，又名五行草、長壽菜等，適應性強，分布廣泛。大量研究發現，馬齒莧中含有多種生理活性物質，包括多糖類、有機酸類、黃酮類、生物堿類、萜類、氨基酸、維生素以及礦物質等[2-5]。現代藥理研究表明[6-9]，馬齒莧具有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤以及潤腸通便等功能。本實驗室前期研究結果表明，馬齒莧水提物具有潤腸通便功能，與文獻報道一致。因此，本研究進一步考察馬齒莧粗多糖、脫蛋白多糖、生物堿、水洗脫組分和醇洗脫組分對小鼠腸推進的影響，以揭示其潤腸通便的藥效物質。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1.2 材料

馬齒莧(上海雷允上藥業有限公司，批號：LY1408039)；鹽酸洛哌丁胺(西安楊森制藥有限公司，規格：2 mg，批號：140313152)；通便膠囊(浙江金諾康生物制藥有限公司，規格：0.45 g，批號：G20130569)；羧甲基纖維素鈉(重慶力宏精細化工有限公司，批號：4040109)；活性炭粉(西隴化工股份有限公司，批號：20150230)；AB-8型大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；工業乙醇、丙酮、無水乙醚、鹽酸、氫氧化鈉、氨水、三氯甲烷(國藥集團化學試劑有限公司)。

昆明種小鼠(清潔級，雄性，18～22 g)，購自上海復旦大學醫學院實驗動物科學部，許可證號碼為SCXK(滬)2014-0004。

2 方法

2.1 馬齒莧各組分制備

2.1.1 粗多糖的制備 取馬齒莧藥材200 g，加入15倍體積蒸餾水，浸泡4 h，回流提取2次，每次1.5 h，經200目濾膜過濾、合并濾液、減壓濃縮制得水提濃縮液。在濃縮液中緩慢加入95%工業乙醇，使醇含量達到80%左右，置于4 ℃的冰箱中沉淀分離24 h，分別抽濾分離收集上清液與離心分離下層沉淀。沉淀物依次經無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌數次，以除去殘留色素等雜質，真空干燥，制得馬齒莧粗多糖，計算得率。

2.1.2 脫蛋白多糖的制備 取適量馬齒莧粗多糖，用蒸餾水溶解、混勻，按照料液體積比為3∶1加入三氯甲烷和正丁醇(6∶1)的混合液，振搖，離心，取水相，重復上述步驟5次，得到精制多糖上清液，減壓濃縮后，冷凍干燥，制得脫蛋白多糖，計算得率。

權重分配的合理與否將直接影響到評價結果的準確性［5］。根據評價指標對普查工作戰略目標的重要性應分別賦予不同的權重。采用AHP法［6］，通過一致性檢驗的即為該權重；未通過一致性檢驗的指標反饋給專家，重新進行兩兩對比，直到所有的指標的權重都通過一致性檢驗。最后將所有專家得出的權重求權重算術平均值，得出的指標體系的權重的結果見表1。

2.1.3 生物堿的制備 取馬齒莧水提醇沉上清液，用36%～38%鹽酸溶液調節其pH為3～4，攪拌均勻，抽濾，收集濾液。用10%氨水溶液調節濾液pH為9～10，攪拌均勻，用三氯甲烷進行萃取，重復2次，合并三氯甲烷萃取液，減壓回收三氯甲烷，制得馬齒莧生物堿，計算得率。

2.1.4 水洗脫組分和醇洗脫組分的制備 取適量馬齒莧水提醇沉上清液，稀釋至一定濃度，超聲使均勻；調節吸附柱內液面高度，一次性加入上樣液，上樣流速為5 mL·min-1，上樣液緩慢浸入大孔吸附樹脂至液面貼近樹脂平面，分別用5倍柱體積蒸餾水和70%乙醇洗脫，洗脫速度為10 mL·min-1，合并洗脫液，經減壓濃縮、冷凍干燥，制得AB-8水洗脫組分和70%乙醇洗脫組分，計算得率。

2.2 藥物配制

2.2.1 10%碳墨混懸液的配制 稱取羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)2 g，加蒸餾水150 mL煮沸至透明，稱取活性碳粉20 g加入上述溶液中煮沸3次，待溶液涼后定容到200 mL，于冰箱中4 ℃保存，用前搖勻。

2.2.2 洛哌丁胺混懸液的配制 洛哌丁胺劑量為10 mg·kg-1。將膠囊內容物研碎呈粉末后用1% CMC-Na溶液配制0.5 mg·mL-1的混懸液，充分搖勻后使用。

2.2.3 受試物溶液配制 將通便膠囊內容物1.1 g、馬齒莧粗多糖1.3 g、馬齒莧脫蛋白多糖0.9 g、生物堿0.003 g、水洗組分0.03 g、醇洗組分0.06 g，分別用10%碳墨混懸液配成相應濃度，充分混勻，現配現用。

2.3 馬齒莧各組分對腸蠕動抑制模型小鼠小腸推進的影響

取雄性昆明種小鼠(18～22 g)，隨機分為正常組、模型組、陽性對照組、粗多糖組、脫蛋白多糖組、生物堿組、水洗組分組、醇洗組分組，每組10只。實驗前各組小鼠禁食不禁水20 h，正常組灌胃給予1% CMC-Na溶液，其余各組均灌胃給予鹽酸洛哌丁胺溶液(10 mg·kg-1)，給藥體積均為20 mL·kg-1，30 min后，正常組和模型組灌胃給予10%碳墨混懸液，其余各組小鼠均灌胃給予含相應濃度受試樣品的10%碳墨混懸液，給藥體積均為0.5 mL/只，各受試溶液組小鼠的給藥劑量均相當于《中華人民共和國藥典》規定人用最大生藥劑量的50倍；25 min后，脫頸椎處死動物，測量腸管長度為“小腸總長度”，從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進長度”，按公式(1)計算墨汁推進率。

(1)

2.4 脫蛋白多糖對正常小鼠小腸推進影響的量效關系

取雄性昆明種小鼠(18～22 g)，隨機分為正常組、陽性對照組、脫蛋白多糖低劑量組(0.4 g·kg-1)、脫蛋白多糖中劑量組(0.8 g·kg-1)、脫蛋白多糖高劑量組(1.6 g·kg-1)，每組10只。實驗前各組小鼠禁食不禁水20 h，正常組灌服10%碳墨混懸液，脫蛋白多糖各組灌胃給予含相應濃度受試樣品的10%碳墨混懸液，給藥體積均為0.5 mL/只，25 min后脫頸椎處死動物，按前述方法測定腸管長度，并計算墨汁推進率。

2.5 脫蛋白多糖對腸蠕動抑制模型小鼠小腸推進影響的量效關系

取雄性昆明種小鼠(18～22 g)，隨機分為正常組、模型組、陽性對照組、脫蛋白多糖低劑量組(0.4 g·kg-1)、脫蛋白多糖中劑量組(0.8 g·kg-1)、脫蛋白多糖高劑量組(1.6 g·kg-1)，每組10只。實驗前各組小鼠禁食不禁水20 h，正常組灌胃給予1% CMC-Na溶液，其余各組均灌胃給予鹽酸洛哌丁胺溶液(10 mg·kg-1)，給藥體積均為20 mL·kg-1，30 min后，正常組和模型組灌胃給予10%碳墨混懸液，其余各組小鼠均灌胃給予含相應濃度受試樣品的10%碳墨混懸液，給藥體積均為0.5 mL/只，25 min后、脫頸椎處死動物，按前述方法測定腸管長度，并計算墨汁推進率。

2.6 數據統計與分析

3 結果

3.1 馬齒莧各活性組分制備

按照2.1中方法制備馬齒莧粗多糖得率為20.5%(以生藥計)，脫蛋白多糖為14.0%(以生藥計)，生物堿得率為0.04%(以生藥計)，水洗組分和醇洗組分得率分別為0.49%(以生藥計)和0.94%(以生藥計)。

3.2 馬齒莧各活性組分對腸蠕動抑制模型小鼠小腸推進的影響

表1數據表明，模型組小鼠的小腸推進率顯著低于正常組(P<0.01)，說明小鼠腸蠕動抑制模型制備成功；與模型組比較，陽性對照組小鼠的小腸推進率顯著高于模型組(P<0.05)，粗多糖組與脫蛋白多糖小腸推進率顯著高于模型組(P<0.01)。

表1 馬齒莧各活性組分對腸蠕動抑制模型小鼠小腸推進的影響

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 脫蛋白多糖對正常小鼠腸推進影響的量效關系

表2結果顯示脫蛋白多糖中、高劑量組與正常組比較均有統計學差異(P<0.01)，表明脫蛋白多糖有促進正常小鼠小腸推進的作用，且促進作用隨著劑量增大而增強，呈現劑量依賴關系。

表2 脫蛋白多糖對正常小鼠小腸推進影響的量效關系

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 脫蛋白多糖對腸蠕動抑制模型小鼠腸推進影響的量效關系

表3結果表明，與正常組相比，模型組小鼠的小腸推進率顯著降低(P<0.01)，證明小鼠腸蠕動抑制模型復制成功；與模型組相比，陽性對照組小鼠的小腸推進率顯著增加(P<0.05)，馬齒莧脫蛋白多糖低、中、高劑量組小鼠的小腸推進率均顯著高于模型組，且促進小腸推進作用呈現明顯的劑量依賴關系。

表3 脫蛋白多糖對腸蠕動抑制模型小鼠腸推進影響的量效關系

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

有研究證實[10-11]，馬齒莧可修復潰瘍性結腸炎(UC)模型小鼠的組織損傷，緩解功能性胃腸病患者的各種臨床癥狀等。本實驗室前期研究表明，馬齒莧水提物可促進小鼠腸推進，目前文獻沒有報道馬齒莧潤腸通便的物質基礎，也沒有報道馬齒莧多糖具有促進小腸推進作用。

通過本實驗發現，馬齒莧脫蛋白多糖對正常小鼠也具有一定的促進小腸推進作用，對腸蠕動抑制模型小鼠小腸推進促進作用更加顯著。另外，馬齒莧脫蛋白多糖的腸推進的促進作用呈良好的量效關系。據文獻報道[12-13]，黑木耳多糖可促進正常小鼠的腸胃運動，并拮抗新斯的明所致腸胃功能亢進；鎖陽多糖對小鼠腸推進具有明顯的促進作用，并且可以拮抗由阿托品引起的小鼠腸蠕動的抑制。文獻沒有報道馬齒莧多糖，特別是馬齒莧脫蛋白多糖對小鼠小腸推進的促進作用，有關小腸推進的促進作用機制有待進一步研究。

本研究的發現為評價馬齒莧的潤腸通便功能提供依據，也揭示了馬齒莧多糖為馬齒莧潤腸通便的物質基礎，為開發馬齒莧潤腸通便藥物或保健品奠定了藥效物質基礎。

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PreparationofActiveIngredientsfromPortulacaoleraceaandScreeningofTheirActivitiesonIntestinalPropulsion

YUAN Shuqing，WUChunzhen，HUGaoda，ZHANGQi，LIUYing*

(SinopharmHealthIndustryResearchCo.Ltd，Shanghai201203，China)

Objective：To elucidate the pharmacodynamic substances of smoothing intestine and relieving constipation inPortulacaoleracea.Methods：The water extraction and alcohol precipitation method was used to prepare the total polysaccharides and alkaloids，and a mixture of chloroform andn-butanol used to obtain removing protein polysaccharides.Meanwhile，the low polarity components and high polarity components were prepared by AB-8 macroporous resin.The loperamide-induced peristaltic inhibition model in mice was reproduced by measurement of carbon ink propulsion and used to screen the ingredients.Results：five active components fromP.oleraceaL were obtained and only total polysaccharides and removing protein polysaccharides showed to be potent on intestinal propulsion in mice，in which the removing protein polysaccharides were more potent.Conclusion：The pharmacodynamic substances of smoothing intestine and relieving constipation inP.oleraceaare polysaccharide components.

Portulacaoleracea；active components；removing protein polysaccharides；intestinal propulsion

上海市衛生與計劃生育委員會資助項目(ZY3-FWMS-1-1001-KYJS-49，2014—2016)

] 劉英，碩士生導師，研究員，研究方向：藥理研究；Tel：(021)2057000-8787，E-mail：liuyingsipi@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.7.015

2016-11-01)

*[