基于UPLC/Q-TOF-MSE分析小續命湯有效成分組的化學成分△

陳茜睿，楊志宏

(中國醫學科學院 藥用植物研究所，北京 100193)

·基礎研究·

基于UPLC/Q-TOF-MSE分析小續命湯有效成分組的化學成分△

陳茜睿，楊志宏*

(中國醫學科學院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：快速闡明中藥復方小續命湯的化學組成。方法：利用超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜聯用技術(UPLC/Q-TOF-MSE)對小續命湯有效成分組進行了快速分析和成分鑒定。液相條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，以0.1%甲酸水-乙腈為流動相進行梯度洗脫，柱溫40 ℃，流速0.35 mL·min-1；質譜條件：采用ESI源，正、負離子模式下分別進行數據采集。結果：通過與對照品信息的提取辨識、與數據庫數據的匹配指認以及對文獻資料的比照分析，從小續命湯有效成分組中鑒定了42個化合物，主要包括黃酮、生物堿、三萜皂苷等類成分，并歸屬了各化合物的單味中藥來源。結論：本研究比較全面地闡明了小續命湯有效成分組的化學組成，為此中藥復方的質量控制提供參考，也為其深入的藥效物質基礎及藥理作用研究奠定了基礎。

小續命湯有效成分組；UPLC/Q-TOF-MSE；化學成分

小續命湯是由防風、麻黃、防己、人參、黃芩、桂枝、芍藥、川芎、杏仁、附子、甘草、生姜12味中藥組成的中藥復方，是中醫治療中風及中風后遺癥的經典方劑。近年來研究顯示，小續命湯不僅對中風及中風后遺癥具有明顯的治療作用，對阿爾茨海默病、糖尿病周圍神經病變、頑固性高血壓等其他疾病也具有一定療效[1-5]。小續命湯有效成分組是小續命湯復方中與臨床治療腦卒中密切相關的藥理活性成分[6]，近年來雖有文獻[7-8]對小續命湯有效成分組中幾味成分進行報道，但其中大部分化學成分仍未知。為了闡述該復方的藥效物質基礎和作用機制，進行其化學成分研究尤為迫切。

飛行時間質譜儀(Q-TOF-MSE)是高分辨質譜，其顯著特征是既能準確測定化合物的精確分子量，又兼顧高靈敏度和高檢測速度。超高效液相色譜串聯飛行時間質譜技術(UPLC/Q-TOF-MSE)，即通過UPLC的高分離效率與Q-TOF-MSE的極高分辨率相結合，成為當前天然藥物復雜體系中活性成分快速分離和鑒定的有力手段。本實驗首次應用UPLC/Q-TOF-MSE技術對小續命湯有效成分組進行分析，結合色譜保留時間、精確分子質量、碎片離子信息，參考對照品的色譜、質譜行為和相關文獻，對主要色譜峰進行歸屬和鑒定，對未知化合物進行結構推測。本研究較全面地闡明了小續命湯有效成分組的化學組成，為該復方開展后續的藥效物質基礎及藥理作用研究奠定了基礎。

1 材料

ACQUITYTMUPLC/Q-TOF SYNAPT G2 HDMS 聯用系統，MassLynx V4.1質譜工作站(美國Waters公司)，ChemSpider數據庫。

小續命湯有效成分組粉末由中國醫學科學院藥物研究所杜冠華教授惠贈。對照品：升麻苷(Prim-O-Glucosylcimifugin)，批號：PS08050601；黃芩苷(Baicalin)，批號：PS01260020；苦杏仁苷(Amygdalin)，批號：PS08082904；芍藥苷(Paeoniflorin)，批號：PS13022801；甘草酸(Glycyrrhizic Acid)，批號：PS0126-0020；甘草素(Liquritigenin)，批號：PS15010601；黃芩素(Baicalein)，批號：PS0711-0025；漢黃芩素(Wogonin)，批號：PS14051603；千層紙素A(Oroxylin A)，批號：PS14052203，以上對照品購自成都普思生物科技有限公司。防己諾林堿(Fangchinoline)，批號：141215；苯甲酰新烏頭原堿(Benzoylmesaconine)，批號：141124；人參皂苷Rc(Ginsenoside Rc)，批號：151021；甘草苷(Liquiritin)，批號：160127；異甘草苷(Isoliquiritoside)，批號：160129；千層紙素A葡萄糖醛酸苷(Oroxylin A-7-O-glucuronide)，批號：141220；漢黃芩苷(Wogonoside)，批號：141207，以上對照品購自上海融禾醫藥科技發展有限公司。白楊素(Chrysin，CHR)購自上海同田生物技術有限公司。鹽酸甲基麻黃堿(Methylephedrine Hydrochloride)，批號：171247-200301，購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈、甲酸為色譜級，水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

2 方法

2.1對照品溶液制備

精密稱取各對照品1mg，以甲醇溶解至1mL，作為對照品貯備液，于4℃下避光保存。

2.2供試品溶液制備

小續命湯有效成分組供試溶液：精密稱取有效成分組粉末20mg，于甲醇-水(80∶20，V/V)中超聲溶解，配制成20mg·mL-1混懸液，以甲醇-水(50∶50，V/V)稀釋為10mg·mL-1溶液后，于4℃下12000r·min-1離心10min，取上清液過0.22μm微孔濾膜。

2.3色譜條件

色譜柱：WatersACQUITYUPLCHSST3(100mm×2.1mm，1.8μm)；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈。洗脫程序為：0～10min，10%B；10～30min，10%→20%B；30～33min，20%B；33～41min，20%→35%B；41～46min，35%B；46～50min，35%→70%B；50～52min，70%→95%B。進樣量為5μL；柱溫為40℃；檢測波長范圍為190～320nm，流速為0.35mL·min-1。

2.4質譜條件

氮氣為霧化、錐孔氣；電噴霧電離：正、負離子模式；飛行管檢測模式：W型；毛細管電壓：正離子模式3.0kV，負離子模式2.5kV；錐孔電壓：40V；萃取錐孔：4V；源溫：100℃；脫溶劑氣溫度：350℃；反向錐孔氣流：100L·h-1；脫溶劑氣流：800L·h-1；掃描時間：1s；掃描時間間隔：0.15s；質荷比范圍：m/z100～1200Da；鎖定質量數：正離子模式m/z556.2771，負離子模式m/z554.2615。

3 結果

3.1小續命湯有效成分組主要色譜峰歸屬分析

應用UPLC/Q-TOF-MSE技術分析了小續命湯有效成分組供試品溶液，獲得了其中多個成分的高分辨質譜及多級質譜數據。圖1為正、負離子模式下小續命湯有效成分組供試品溶液總離子流圖。通過分析樣品的總離子流圖，提取離子色譜圖，獲得特征碎片離子，再綜合保留時間，比較對照品和供試品在時間點下的質譜圖，進一步確認色譜峰的歸屬。結果顯示，在42個色譜峰中，峰17、24、26、29、35、36、39來源于黃芩，峰8、12、14來源于防風，峰13、16來源于防己，峰1、2、3來源于麻黃，峰5、15、20、22、27、30、31來源于附子，峰23、25、32、33、34、38來源于人參，峰41來源于川芎，峰4來源于杏仁，峰6、7、28來源于芍藥，峰10、18、19、37、42來源于甘草。

注：A.正離子模式；B.負離子模式。圖1 小續命湯有效成分組樣品總離子流圖

3.2色譜峰的鑒定

通過與對照品比對鑒定，峰3為甲基麻黃堿，峰7為芍藥苷，峰8為升麻苷，峰13為防己諾林堿，峰15為苯甲酰新烏頭堿，峰17為黃芩苷，峰33為人參皂苷Rc，根據以上對照品總結的色譜和質譜規律，結合供試品中各色譜峰的精確的MS數據(分子式、精確分子量、特征二級和/或三級碎片離子峰)，再考慮到小續命湯有效成分組中已報道過的化學成分[9-16]，推測了各色譜峰的可能結構，見表1。從化合物的類別來看，黃酮類和生物堿類含量較高，對復方的貢獻較大，并初步識別了色譜峰來源鑒定出的38個成分。包括10個黃酮類成分：黃芩苷(峰17)、甘草素(峰19)、千層紙素A葡萄糖醛酸苷(峰24)、漢黃芩苷(峰26)、黃芩素(峰29)、漢黃芩素(峰35)、白楊素(峰36)、千層紙素A(峰39)、甘草苷(峰10)和異甘草苷(峰18)。3個色原酮類成分：升麻素(峰12)、升麻苷(峰8)和5-O-甲基維斯阿米醇苷(峰14)。2個三萜類成分：甘草酸(峰37)和甘草次酸(峰42)。3個單萜類成分：芍藥苷(峰7)、芍藥內酯苷(峰6)和苯甲酰芍藥苷(峰28)。12個生物堿類成分：麻黃堿(峰1)、偽麻黃堿(峰2)、甲基麻黃堿(峰3)、烏頭堿(峰31)、次烏頭堿(峰30)、新烏頭堿(峰27)、苯甲酰新烏頭堿(峰15)、苯甲酰次烏頭堿(峰22)、苯甲酰烏頭原堿(峰20)、附子靈(峰5)、粉防己堿(峰16)和防己諾林堿(峰13)。6個三萜皂苷類：人參皂苷Rg1(峰23)、人參皂苷Rb1(峰32)、人參皂苷Rb2(峰34)、人參皂苷Re(峰25)、人參皂苷Rc(峰33)、人參皂苷Rd(峰38)。1個氰苷類成分：苦杏仁苷(峰4)。1種揮發油類成分：藁本內酯(峰41)。

對于部分未知化合物，將其中4個未知化合物進行了初步推測。它們分別可能是：正離子模式下檢測到的9、21、40號峰，以及負離子模式下檢測到的11號峰。并推測它們分別為輪環藤酚堿、燈盞花甲素、黃芩新素Ⅱ以及芹糖基甘草苷。此外，通過比較對照品、小續命湯樣品色譜峰出峰時間，發現峰4、10、18、19樣品保留時間與對照品相同，但因其質譜碎片離子信號在樣品與對照品中存在偏差，這可能是由于樣品中組分相對復雜，影響了碎片離子信號的穩定程度，因而僅推測其可能為苦杏仁苷、甘草苷、黃芩苷、異甘草苷。

3.3黃酮類化合物的結構鑒定

根據峰17、24、26、29、35、36、39的精確質量數得到的化合物不飽和度均在10以上，推測均為黃酮類化合物。黃酮類成分的準分子離子峰大多為[M+H]+，其質譜碎裂特征主要是丟失中性分子CO和H2O。結構中有甲基取代基的化合物還可以丟失一分子甲基。同時，一些黃酮類成分還存在著逆狄爾斯-阿德爾反應(RetroDiels-Alderreaction，RDA)裂解。

化合物17正離子給出m/z447.0933[M+H]+，分子式為C21H18O11。推測為一連有葡萄糖醛酸結構的黃酮化合物，且屬于單糖苷類，苷元可能含有鄰二酚羥基。經與對照品比對，發現與黃芩苷的結構和質譜數據一致，17可能為黃芩苷。

化合物26正離子給出m/z461.1084[M+H]+，分子式為C22H20O11。化合物24正離子給出m/z483.0903[M+Na]+，分子式為C22H20O11，二者應是一對同分異構體。在黃酮母核的A環上均有葡萄糖醛酸基團，由于26與17分子結構相差一個CH2基團，兩者可能為漢黃芩苷和千層紙素A葡萄糖醛酸苷，而只靠質譜數據很難將二者區分開，通過與已知的對照品進行質譜數據以及保留時間的對比，最終確定了化合物24為千層紙素A葡萄糖醛酸苷，化合物26鑒定為漢黃芩苷。

化合物29正離子給出m/z271.061[M+H]+，分子式為C15H10O5，表明為一黃酮類化合物，而非黃酮苷類。根據其化合物的分子質量和不飽和度推測3個氧原子的取代基為酚羥基取代，而非甲氧基取代，經與對照品比對，化合物29鑒定為黃芩素。

化合物35正離子給出m/z285.076 3[M+H]+，分子式為C16H12O5。與此相同的化合物39正離子給出m/z285.076 3[M+H]+，判斷二者為一對同分異構體。根據其分子式和不飽和度推測此類化合物應為O-甲基化的黃酮類物質，而漢黃芩素和千層紙素A這兩個黃酮類成分可能從黃芩中提取得到，與對照品對比，其保留時間及分子離子峰一致，判斷化合物35為漢黃芩素，39為千層紙素A。

化合物36正離子給出m/z255.065 7[M+H]+，分子式為C15H10O5。通過與已知的對照品進行質譜數據以及保留時間的對比，最終確定了化合物36為白楊素。

表1 小續命湯有效成分組化合物質譜數據

表1(續)

4 討論

小續命湯復方由12味中藥組成，其中含有生物堿、黃酮、三萜皂苷等類復雜成分。要將這些不同類型的化合物用同一色譜條件進行分離，是相當困難的。基于對實驗室原有的液相分離條件進行完善，并根據超高效液相色譜對流動相及色譜柱、柱溫和流速的要求，考察了添加甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨等試劑對分離的影響，并比較了甲酸的不同酸度對分離的影響，最終確定了以0.1%甲酸-乙腈為流動相梯度洗脫效果最佳。同時，分別進行了柱溫30、35、40 ℃對于分離的影響，確定了柱溫為40 ℃時分離效果最佳。實驗結果表明，不添加銨鹽，僅調節流動相pH值，能夠使有效成分組中各成分得到較好分離，并得到良好的響應信號。

本實驗對主要色譜峰的來源進行了歸屬和鑒定，共歸屬了42個主要色譜峰。盡管小續命湯組方各單味藥量相差不多，但對于全方的化學貢獻卻明顯不同，其中防己、防風、黃芩、芍藥、甘草貢獻較大。而復方BPI圖中仍有一些色譜峰并未找到與其相對應的物質歸屬，這可能是由于該方組方成分復雜及提取過程中產生多種物質間反應，導致尚存在一定量的未鑒定成分。同時，本文首次報道了由小續命湯有效成分組中檢定出如下成分：烏頭堿，新烏頭堿，次烏頭堿，苯甲酰烏頭原堿，苯甲酰新烏頭堿，苯甲酰次烏頭堿，附子靈，人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1，甲基麻黃堿，芍藥內酯苷和苯甲酰芍藥苷。

結合文獻分析，已鑒定的化合物中黃芩素抑制黑質星形膠質細胞的生成，并能增加多巴胺能神經元的數量，同時其對谷氨酸引起的神經元損傷具有保護作用，芍藥苷有抑制膠質細胞激活、保護神經元免受損傷的作用，千層紙素A具有促神經發生作用。這些化合物可能通過協同或互補在小續命湯中發揮治療腦缺血、阿爾茨海默病、高血脂等疾病的作用。

UPLC/Q-TOF-MSE技術可以快速、方便、有效地對中藥復方組分進行特征圖譜表征和結構分析，利用這一方法不僅對小續命湯復方的研究有著重要的貢獻，對其他中藥復方現代化的研究也有著異曲同工之處，且具有巨大的應用潛力。然而此方法仍存在一些不足之處，如無法區分一些同分異構體、手性化合物，無法提供化合物的立體構型。為了得到化合物的具體結構，仍需使用其他方法加以支持。

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UPLC/Q-TOF-MSEBasedAnalysisofChemicalCompositionofAF-Xiao-Xu-MingDecoction

CHEN Xirui，YANG Zhihong*

(Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100193，China)

Objective：In order to clarify the chemical composition and the source of active component Xiao-Xu-Ming decoction (AF-XXMD) quickly and comprehensively，whole and individual herbs of AF-Xiao-Xu-Ming decoction were analyzed by Ultra-Performance Liquid Chromatography with Quadrupole-Time-of-Flight Mass Spectrometry(UPLC/Q-TOF-MSE).Methods：Under identical experiment conditions，chromatography results were compared between experiment groups.A Waters ACQUITY UPLC HSS T3 column (100 mm×2.1 mm，1.8 μm) was used with 0.1% formic acid solution (A) -acetonitrile (B) as the mobile phase for gradient elution.The flow rate was set to 0.35 mL·min-1and the column temperature was maintained at 40 ℃.Electrospray ion (ESI) source was applied for the qualitative analysis under the positive and negative ion mode.Results：Finally，based on comparison with standard samples，database matching analysis and reviewing relevant literature，42 compounds were identified from AF-Xiao-Xu-Ming decoction.The results implied that flavonoids，alkaloids and triterpenoid saponins were the main components in the effective part of AF-Xiao-Xu-Ming decoction.The herbal sources of these peaks were assigned.Conclusion：This established method is simple and rapid for elucidation the constituents of AF-Xiao-Xu-Ming decoction and the results could be used for the quality control and the further material basis research for AF-Xiao-Xu-Ming decoction.

AF-Xiao-Xu-Ming decoction；UPLC/Q-TOF-MSE；chemical composition

國家自然科學基金(81273654，81473579，81102879)；國家重大新藥創制專項(2013ZX09103002-022)

] 楊志宏，副研究員，碩士生導師，研究方向：藥物代謝動力學及中藥復方配伍機制；Tel：(010)57833219，E-mail：zhyang@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.012

2016-04-13)

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