沉香醇提物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用△

王燦紅，王帥，彭德乾，劉洋洋，郭鵬，*，魏建和，*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護與開發重點實驗室，國家中醫藥管理局沉香可持續利用重點研究室)，海南 ?？?570311；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所(中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，瀕危藥材繁育國家工程實驗室)，北京 100193；3.海南醫學院 藥學院，海南 海口 571199)

·專題·

沉香醇提物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用△

王燦紅1，王帥2，彭德乾3，劉洋洋1，郭鵬1，2*，魏建和1，2*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護與開發重點實驗室，國家中醫藥管理局沉香可持續利用重點研究室)，海南 海口 570311；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所(中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，瀕危藥材繁育國家工程實驗室)，北京 100193；3.海南醫學院 藥學院，海南 海口 571199)

目的：探討沉香醇提物對四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝損傷的保護作用。方法：采用CCl4腹腔注射制備小鼠急性肝損傷模型，給藥處理后計算肝臟指數；檢測血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)活性；肝組織勻漿液中髓過氧化物酶(MPO)、一氧化氮(NO)、總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)；肝臟進行病理切片觀察；酶聯免疫法(ELISA)檢測血清中白介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10)的表達水平。結果：與模型組相比，通體沉香醇提物能劑量依賴性顯著降低血清ALT、AST活性，降低MPO活性、NO含量，提高T-AOC能力及SOD活性；緩解肝臟組織病理損傷；減低IL-1β和升高IL-10的表達水平，且通體沉香醇提物高劑量效果最好，優于等劑量的野生沉香和火烙沉香醇提物。結論：沉香醇提物對肝損傷有保護作用，其機制可能與抗氧化應激，抑制脂質過氧化及抗炎作用有關。

沉香醇提物；四氯化碳；急性肝損傷；抗氧化損傷；抗炎

國產沉香為瑞香科(Thymelaeaceae)植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg.含樹脂的木材，主產于海南、廣東、廣西、云南等地。沉香味辛、苦，性微溫，有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效[1]。沉香作藥用已有千余年歷史，有“藥中黃金”之稱?，F代藥理研究表明，沉香具有鎮痛[2-3]、抗炎[4-5]、抗氧化[6-7]、鎮靜安神[8]等較廣泛的藥理活性，但受天然沉香藥材匱乏的影響，現代藥理研究還較粗淺；自2011年課題組發明的高效、穩定的白木香“通體結香”技術在國內外較廣泛的應用，優質沉香已開始大規模產業化供應市場和臨床[9]，也促進了沉香功效研究的深入。有研究顯示，沉香葉醇提物有肝臟保護作用[10]，但關于沉香本身防治肝損傷的研究尚未見報道。因此，本實驗采用四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝損傷模型，觀察沉香醇提物的保肝作用及可能機制，為沉香進一步研究開發及臨床應用提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1藥物

通體結香技術(專利號：ZL201010104119.5)產沉香(簡稱通體沉香)原料來自廣東化州，野生沉香和火烙法產沉香(簡稱火烙沉香)購自廣東省茂名市化州，由中國醫學科學院藥用植物研究所魏建和研究員鑒定均為白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg.產沉香。稱取通體沉香1000g粉碎后，置于圓底燒瓶容器中，按通體沉香重量：95%乙醇體積=1∶5的比例，向所述圓底燒瓶中加入5L95%乙醇，浸泡2h后，將電熱套緩緩加熱至溶液沸騰，并保持微沸1h，停止加熱，自然冷卻至室溫后過濾，過濾后的藥渣按照以上操作重復3次，最后合并濾液，減壓濃縮得浸膏，繼續蒸干4h，至無醇味得到黑褐色固體即通體沉香醇提物140g，浸出率為14%，因其易吸潮，故置-20℃密封保存備用；野生沉香和火烙沉香醇提物制備方法同上，所得醇提物浸出率分別為10.5%和14%。

1.2動物

雄性ICR小鼠70只，體重18～22g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCKX(京)2014-0001。飼養于中國醫學科學院藥用植物研究所SPF級動物房，溫度20～24℃，濕度52%～58%，白晝光照周期12h/12h，自由飲水和攝食，適應性喂養3d后進行實驗。

1.3試劑

AST、ALT 檢測試劑盒購于中生北控生物科技股份有限公司；四氯化碳(CCl4)購自上海國藥集團化學試劑有限公司?？捡R斯亮藍蛋白定量試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、髓過氧化物酶(MPO)、一氧化氮(NO)購于南京建成生物科技公司，ELISA試劑盒IL-1β、IL-10購自Bossbio公司。

1.4儀器

離心機(德國Heraeus公司，型號：Labofuge400R)；全自動生化儀(美國Beckman Coulter公司，型號：AU480)；酶標儀(美國Bio-Tek公司，型號：MQX200)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus，型號：CKX41)。

2 方法

2.1模型的建立與分組給藥

70只小鼠隨機分別為正常組、模型組、野生沉香醇提物組(相當于生藥2.84g/kg)、火烙沉香醇提物組(相當于生藥2.84g/kg)、通體沉香醇提物低、中、高劑量組(相當于生藥0.71，1.42，2.84g/kg)。正常組和模型組給予等體積的蒸餾水灌胃，受試藥物組灌胃給予相應藥物，20mL/kg，連續給藥7d。末次給藥1h后，除正常組外，每只小鼠腹腔注射0.1% CCl4花生油溶液，10mL/kg，復制急性肝損傷模型。禁食不禁水，24h后稱體重，摘眼球取血，3000rpm離心15min，取血清，凍存于-20℃。脫臼處死動物，摘取肝臟稱重，小心用剪刀剪取一塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定，做病理組織切片觀察；剩余肝臟置于-80℃保存，用于其他指標檢測。

2.2肝臟指數

2.3肝臟病理切片觀察

取肝臟組織，置4%多聚甲醛溶液中固定，按照常規脫水，石蠟包埋，切片5μm厚度，進行蘇木精-伊紅染色，在高倍顯微鏡(×400)下觀察肝細胞脂肪變性、炎癥浸潤、肝細胞脫落、壞死等。

2.4肝組織勻漿上清中MPO、NO、T-AOC和SOD的檢測

稱取-80℃保存的肝組織約100mg，按1∶9加入生理鹽水，冰浴、充分勻漿，制備10% 的組織勻漿液，4℃，3000rpm離心15min，吸取上清，凍存于-80℃；通過BCA蛋白定量試劑盒檢測組織上清的蛋白濃度，按照脂質過氧化及抗氧化試劑盒操作說明檢測MPO、NO、T-AOC和SOD含量。

2.5采用ELISA方法檢測血清中IL-1β和IL-10

摘眼球采血后，3000 rpm離心15 min，吸取上清，凍存于-20 ℃。參照試劑盒說明書操作檢測IL-1β和IL-10含量。

2.6統計學處理

3 結果

3.1對小鼠肝臟重量和肝臟指數的影響

與正常組相比，模型組小鼠的肝臟重量和肝臟指數均顯著升高(P<0.01)，說明CCl4導致肝臟發生明顯腫脹。與模型組相比，野生沉香醇提物和通體沉香醇提物均能不同程度顯著降低肝臟重量和肝臟指數(P<0.05)，見表1。

表1 對小鼠肝臟重量和肝臟指數的影響

注：與正常組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05

3.2對血清中ALT和AST的影響

與正常組相比，模型組小鼠血清中ALT和AST水平均顯著升高(P<0.001)，表明肝臟出現顯著損傷，模型制備成功。與模型組相比，野生沉香醇提物、火烙沉香醇提物和通體沉香醇提物均能不同程度降低ALT和AST水平(P<0.05，P<0.01)，且通體沉香醇提物2.84g/kg效果最顯著，見表2。

3.3對肝組織病理切片形態學的影響

肝組織切片結果顯示，正常組肝小葉結構清晰，細胞排列整齊，大小均勻無壞死、變性等病理變化，未見炎癥細胞浸潤(見圖1A)。模型組肝小葉結構嚴重破壞，細胞排列紊亂，大面積肝細胞壞死或細胞核溶解，可見大量炎癥細胞浸潤和壞死灶(見圖1B)。

表2 對血清中ALT和AST的影響

注：與正常組相比，***P<0.001；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01而野生沉香、火烙沉香和通體沉香醇提物組均不同程度改善肝細胞損傷，其中通體沉香醇提物2.84 g/kg 組效果最好，肝細胞壞死、炎癥細胞浸潤等均較顯著減輕(見圖1G)；野生沉香醇提物作用次之(見圖1C)；通體沉香醇提物1.42 g/kg組與火烙沉香醇提物組效果相當(見圖1F和圖1D)；而通體沉香醇提物0.71 g/kg組改善肝損傷程度較輕，肝細胞仍見輕度腫脹，炎癥細胞浸潤，但灶性壞死顯著減少(見圖1E)。

3.4對肝臟組織勻漿中MPO、NO、T-AOC和SOD的影響

相比正常組，模型組髓過氧化物酶MPO活性和NO的含量顯著升高(P<0.01)，而總抗氧化物能力T-AOC和SOD活性則顯著降低(P<0.05)。而給予各沉香醇提物后均不同程度的降低MPO活性和NO含量(P<0.01)，升高T-AOC能力和SOD活性(P<0.05，P<0.01)，且通體沉香醇提物呈現劑量依賴性地降低或升高，見表3。

注：A：正常對照；B：模型對照；C：野生沉香醇提物 2.84 g/kg；D：火烙沉香醇提物 2.84 g/kg；E：通體沉香醇提物 0.71 g/kg；F：通體沉香醇提物 1.42 g/kg；G：通體沉香醇提物 2.84 g/kg圖1 對肝損傷小鼠肝組織病理形態學的影響(HE，×400)

組別劑量(g/kg)MPO(U/g)NO(μmol/g)T-AOC(U/mg)SOD(U/mg)正常對照1.08±0.432.36±0.260.64±0.19237.32±52.75模型對照4.40±0.32**4.48±0.97**0.47±0.08*193.99±27.39*野生沉香醇提物2.843.10±0.28##1.97±0.51##0.56±0.07#277.35±53.28##火烙沉香醇提物2.844.02±0.501.84±0.66##0.84±0.17##283.85±73.64##通體沉香醇提物0.713.22±0.44##1.60±0.26##0.51±0.19263.29±67.43#1.422.71±0.67##1.53±0.39##0.60±0.09#263.43±61.92#2.840.83±0.22##1.42±0.66##0.66±0.16#287.69±79.52#

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

3.5對血清中IL-1β和IL-10的影響

相比正常組，模型組炎性細胞因子IL-1β水平顯著升高(P<0.01)，而抗炎細胞因子IL-10則顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，各沉香醇提物組均不同程度降低炎性細胞因子IL-1β和升高抗炎細胞因子IL-10水平(P<0.01)，且通體沉香醇提物呈現劑量依賴性，見表4。

表4 對血清中IL-1β和IL-10的影響

注：與正常組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01

4 討論

肝臟是人體最大的實質器官，也是解毒代謝的重要場所。當各種化學物質、藥物、毒物及機體代謝產物等超過肝臟負荷則對其造成損傷。CCl4是經典的誘導肝損傷的化學物質，其誘導肝損傷的機制為，CCl4產生的大量有毒氯自由基代謝產物，損傷肝細胞DNA和生物膜，引起脂質過氧化降解；細胞內各種酶、毒素等釋放到血液，誘導炎癥反應發生，促進肝星形細胞(HSC)增殖、分化，導致肝纖維化；嚴重則激活細胞內凋亡相關蛋白，最終誘發肝細胞凋亡、壞死[11]。

CCl4在肝細胞內經肝細胞色素P450代謝酶激活，生成大量氯自由基攻擊肝細胞膜引發脂質過氧化，引起肝細胞膜通透性增高，使正常情況下主要分布于肝細胞漿和線粒體的ALT、AST大量釋放入血，使血清中酶的活性顯著增高，檢測血清中ALT、AST升高情況能反應肝細胞壞死的程度[12]；病理損傷可見肝臟腫脹、炎癥細胞浸潤、肝細胞空泡變性和灶性壞死等[13]。本實驗結果顯示，通體沉香醇提物呈劑量依賴性地降低肝損傷小鼠血清中AST、ALT的水平，減低肝臟重量和肝臟指數，并能顯著減輕肝組織的病理損傷程度，提示通體沉香醇提物能夠有效改善急性肝損傷小鼠的肝功能，對肝臟損傷起保護作用。

目前公認的CCl4肝損傷的作用機制主要是脂質過氧化反應。CCl4作用機體后，可產生大量過氧化自由基，在MPO等的催化反應下形成大量脂質過氧化物MPO、NO、MDA、ROS等，它們可嚴重破壞細胞膜結構，導致細胞腫脹、壞死[14-15]。正常情況下，機體的抗氧化防御系統可清除自由基，修復損傷及誘導總抗氧化能力T-AOC、抗氧化酶SOD、GSH-Px等的分泌。當化學藥物誘導肝損傷后，會導致抗氧化能力降低，同時促進過氧化物的產生[16]。當體內毒素激活巨噬細胞、多形核白細胞等，能誘發誘導型NOS合成大量NO，對鄰近組織產生毒性，也參與炎癥反應；同時NO也是參與氧化應激損傷的主要自由基之一，其含量增加可抑制多種與線粒體有關的酶，導致自由基產生增多，加重氧化應激反應[17]。本實驗結果顯示，通體沉香醇提物呈劑量依賴性顯著降低肝損傷小鼠肝組織勻漿MPO活性和NO含量，升高總抗氧化能力T-AOC和抗氧化物酶SOD活性，這提示通體沉香醇提物可能是通過減少自由基的生成，抑制脂質過氧化損傷，進而達到保護肝細胞的作用。

有研究報道，CCl4可誘導肝組織枯否細胞(Kuffer cells)分泌炎性細胞因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等引起炎癥反應發生，導致肝損傷[18]。白介素是重要的炎癥介質和免疫調節因子家族，可誘導核轉錄因子NF-κB的激活、表達，啟動炎癥介質、粘附分子等的轉錄引發炎癥，同時又促使IL-1β、IL-6及TNF-α等的大量生成，導致炎癥反應的加重[19]。白介素10(IL-10)是一種多細胞源、多功能的細胞因子，可調節細胞的生長、分化，參與機體炎性調節和免疫反應，是目前公認的抗炎與免疫抑制因子[20]。本實驗結果顯示，通體沉香醇提物呈劑量依賴地降低肝損傷所致的炎性細胞因子IL-1β的分泌，升高抗炎細胞因子IL-10的水平。這提示通體沉香醇提物保肝的機制可能是通過抑制炎癥細胞因子的分泌，阻斷炎癥反應的發生來實現。

綜上所述，通體沉香醇提物呈劑量依賴性地降低CCl4所致肝損傷模型小鼠血清中轉氨酶ALT和AST的活性，降低髓過氧化物酶MPO和NO含量，升高抗氧化物能力T-AOC和抗氧化物酶SOD的活性，降低炎性細胞因子IL-1β水平，升高抗炎細胞因子IL-10的表達，改善肝組織的病理損傷程度，發揮肝臟保護作用，且通體沉香醇提物高劑量效果最好，優于等劑量的野生沉香和火烙沉香醇提物，可能的保肝機制是抗氧化應激及抗炎作用，還可能涉及線粒體損傷和細胞凋亡等信號通路，但具體作用機制有待進一步研究證實。

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ProtectiveEffectsofAlcoholExtractofAgarwoodonAcuteLiverInjuryInducedbyCarbonTetrachlorideinMice

WANG Canhong1，WANG Shuai2，PENG Deqian3，LIU Yangyang1，GUO Peng1，2*，WEI Jianhe1，2*

(1.Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine & Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Agarwood Sustainable Utilization，Hainan Branch Institute of Medicinal Plant，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Haikou 570311，China；2.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Ministry of Education & National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；3.School of Pharmacy，Hainan Medical College，Haikou，Hainan 571199)

Objective：This study is aimed to investigate the hepatoprotective effect of alcohol extract of agarwood on acute liver injury induced by carbon tetrachloride (CCl4) in mice.Methods：Mice were injected with CCl4to establish acute liver injury model.Alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were measured of serum.The myeloperoxidase (MPO)，nitric oxide (NO)，total peroxide (T-AOC) and superoxide dismutase (SOD) of the liver tissue homogenate were measured，and observed degree of liver injury by pathological sections.The interleukin-1β (IL-1β) and Interleukin-10 (IL-10) expression levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results：Compared with the model group，the alcohol extract of Agar-Wit agarwood groups significantly decreased the activities of serum ALT，AST，MPO and NO contents as well as the expression level of IL-1β，enhanced the capacity of T-AOC，the activity of SOD and IL-10 level，and improved pathological injury of liver tissue，especially the alcohol extract of Agar-Wit agarwood 2.84 g/kg group.Conclusion：Alcohol extracts of agarwood show a significantly protective effect on acute liver injury in mice，and its mechanism may be related to anti-oxidative stress，inhibition of lipid peroxidation and anti-inflammatory effect.

Alcohol extracts of agarwood；Carbon tetrachloride；Acute liver injury；Anti-oxidant；Anti-inflammatory

海南省重大科技計劃項目(ZDKJ2016004)；海南省自然科學基金(817290)；國家自然科學基金資助項目(81673545)；中組部“萬人計劃”(99950534)

] 郭鵬，副研究員，碩士生導師，研究方向：心血管藥理學研究，Tel：010-57833235，E-mail：pguo@implad.ac.cn.；魏建和，研究員，博士生導師，研究方向：藥用植物基因資源、分子育種及次生代謝產物調控研究，Tel：010-57833016，E-mail：wjianh@263.net

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.008

2017-05-30)

*[