白木香AsMAPK3基因的克隆及表達分析△

徐艷紅，田美慧，，孫佩文，高志暉，金鉞，魏建和， *

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所(中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，瀕危藥材繁育國家工程實驗室)，北京 100193；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護與開發重點實驗室，國家中醫藥管理局沉香可持續利用重點研究室)，海南 海口 5703113.東北林業大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

·專題·

白木香AsMAPK3基因的克隆及表達分析△

徐艷紅1，田美慧1，3，孫佩文1，高志暉1，金鉞1，魏建和1，2 *

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所(中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，瀕危藥材繁育國家工程實驗室)，北京100193；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護與開發重點實驗室，國家中醫藥管理局沉香可持續利用重點研究室)，海南 海口5703113.東北林業大學，黑龍江 哈爾濱150040)

目的：克隆白木香中分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK) 基因，檢測其組織表達及誘導表達特性。方法：在454高通量測序獲得部分cDNA序列基礎上，利用RACE方法獲得全長cDNA。采用NCBI在線Blastp、DNAman和MEGA4軟件，對序列進行生物信息學分析。隨后，通過熒光定量PCR檢測目的基因的組織表達及誘導表達特性。結果：擴增到了白木香中分裂原活化蛋白激酶基因AsMAPK3，并對其進行了生物信息學分析和表達特性分析。結論：通過AsMAPK3的克隆及分析，為后續驗證其生物學功能奠定了基礎。

白木香；倍半萜；MAPK基因；表達分析

沉香是沉香屬物種受傷害后誘導產生的含樹脂木材，是珍稀瀕危南藥和高價值的世界性資源。但由于長期以來的過度開發使用，全世界產沉香的沉香屬和擬沉香屬物種均列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES)附錄II[1]。瑞香科沉香屬植物白木香Aquilariasinensis(Lour.) Gilg是我國生產沉香的唯一正品植物來源。健康白木香樹體不能產生沉香，只有受到外界傷害后才啟動響應的代謝途徑在其傷口及周圍木質部形成倍半萜等沉香類物質[2-4]。課題組前期應用解剖學、組織化學、生理學等多種手段揭示了“傷害誘導白木香防御反應形成沉香”的結香機制[5-6]。然而，從“傷害信號到倍半萜合酶基因受誘導表達從而合成沉香倍半萜”的分子機制一直未得到清晰揭示，其中信號傳遞的過程還是一個暗箱。

MAPK級聯系統 (MAPK cascade) 被認為是植物細胞將胞外刺激轉換成胞內反應的主要途徑之一[7]，負責外來信號的接收、傳遞和放大，在植物生長發育、生物和非生物脅迫反應以及激素響應等多種信號傳遞途徑中起著十分重要的作用[8-10]。它通過對效應蛋白激酶、轉錄因子等進行磷酸化修飾，調控下游多途徑相關基因的表達[11-12]。MAPK在很多植物中已經被功能鑒定，但藥用植物僅有西府海棠 (Malusmicromalus)[13]、湖北海棠[14]、姜黃 (Curcumalonga)[15]及鐵皮石斛 (Dendrobiumofficinale)[16]中進行了MAPKs基因的克隆和表達分析，白木香中還沒有MAPK的相關報道。

為揭示傷害誘導沉香形成的分子機制，課題組前期進行了健康和傷害白木香莖的轉錄組測序，分析發現傷害誘導一系列轉錄因子和蛋白激酶的表達顯著上調，其中包括MAPK級聯系統[4]。那么，MAPK是否參與傷害信號誘導白木香結香的過程呢？本文在已有研究的基礎上，通過RACE方法克隆了AsMAPK3基因的全長，并對其表達特性進行了分析，為后續深入研究其功能及清晰揭示“傷害信號→沉香倍半萜合成”這一分子網絡奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料及處理 中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所溫室栽培的三年生白木香的根、莖、葉、花用于提取總RNA，檢測AsMAPK3基因的組織表達特異性。三年生白木香莖誘導產生的愈傷分別進行茉莉酸甲酯(MeJA)和水楊酸(SA)處理，于處理后0h，3h，6h，12h，24h，48h 取樣，用于提取總RNA，檢測AsMAPK3基因在健康和傷害愈傷組織中的表達差異。

1.2方法

1.2.1RNA提取 利用RNA提取純化試劑盒 (Aidlab，China) 提取總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，分光光度計NanoDrop2000C (Thermo Scientific，USA) 測定RNA濃度。

1.2.2cDNA第一鏈的合成 RACE cDNA的合成：取約2μg RNA利用Super SMARTTMPCR cDNA合成試劑盒(Clontech，CA，USA)進行反轉錄，利用Advantage?2PCR試劑盒(Clontech，CA，USA)擴增。反轉錄過程為RNA3μL，5′/3′-RACE CDS primer A1μL，SMART IITMA Oligonucleotide1μL，70℃，2min，冰上放置2min，短暫離心后，依次加入：5×First-Strand Buffer2μL，DTT(20mM)1μL，dNTP Mix(10mM)1μL，M-MLV1μL，42℃，1.5hr，再加入20μL Tricine-EDTA Buffer，72℃，7min，-20℃保存備用。熒光定量PCR 分析樣品的cDNA的合成：取約1μg RNA，以MMLV (Takara)為逆轉錄酶，以Oligod(T)18(Takara)為引物，反轉錄合成cDNA第一鏈。

1.2.35′-RACE和3′-RACE454測序得到的unigene 預測為含部分ORF序列的MAPK基因。根據已知的ORF序列片段，利用 primer5.0軟件設計特異性引物 (見表1)，分別進行5′ race和3′ race。PCR擴增體系為25μL：5′/3′-RACE cDNA1.5μL，UPM(10×，通用引物見表1)2.5μL，Gene-specific primer (10μM)0.5μL，10×Advantage2PCR Buffer2.5μL，50×Advantage2Polymerase Mix0.5μL PCR-Grade Water17.5μL。PCR擴增程序為94℃預變性5min；然后94℃30s，72℃3min，5個循環；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5個循環；94℃30s，68℃30s，72℃3min，25個循環；最后72℃延伸10min。巢式PCR為將以上第一輪RACE PCR產物1μL作為模板，用巢式引物和基因特異引物f2進行第二輪PCR。程序為94℃預變性5min；然后94℃30s，68℃30s，72℃3min，20個循環；最后72℃延伸10min。擴增產物用膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收，連接到pMD-19T載體上(Takara)，由金唯智生物科技(北京)有限公司完成測序。將RACE測序結果與454測序結果拼接，得到能夠完整翻譯的基因全長。

1.2.4LD-PCR擴增 根據拼接的結果設計LD-PCR引物(見表1)，以反轉錄的單鏈cDNA為模板，PCR驗證拼接序列的正確性。擴增程序為94℃預變性5min；然后94℃30s，60℃30s，72℃2min，30個循環；最后72℃延伸10min。擴增產物電泳檢測、回收、克隆和測序驗證。

1.2.5AsMAPK3的生物信息學分析 基因編碼蛋白的理化性質預測采用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam (http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html)；采用TMHMM2.0進行跨膜結構域預測；采用SWISS-MODEL (http：//swissmodel.expasy.org/) 進行蛋白質二級結構分析和結構域的三維建模；在線InterProScan對蛋白功能域進行分析。

1.2.6進化樹分析 將AsMAPK3翻譯的氨基酸序列與NCBI數據庫中的MAPK氨基酸序列在線BLASTP比對，通過MEGA4軟件構建 Neighbor-joining 系統進化樹。進化距離的計算采用泊松校正法，Bootstrap 重復次數為1000次。

1.2.7實時熒光定量PCR(real-time PCR) 為了明確AsMAPK3基因在不同組織及不同傷害處理下的表達特性，利用熒光定量PCR進行表達量的檢測。儀器采用伯樂的CFX96TM C1000實時PCR檢測系統。反應體系為：2×SYBR Premix Ex TaqTM5μL；正反向引物濃度均為0.25 μL；cDNA模板0.3 μL；加水補足至10 μL，每個反應體系至少重復3次。實時PCR擴增程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環。實時PCR反應均以三磷酸甘油醛脫氫酶基因 (GAPDH) 為內參[17]

表1 文中用到的引物

2 結果與分析

2.1AsMAPK3基因的5′/3′-RACE及全長cDNA的克隆

為揭示傷害誘導沉香形成的分子機制，利用454測序技術對白木香轉錄組進行了分析[4]，從差異表達基因中檢測到MAPK基因的表達顯著受傷害誘導。根據轉錄組測序得到的部分ORF序列，設計基因特異引物5′/3′-f1和巢式引物5′/3′-f2，進行5′/3′-RACE。擴增結果見圖1，第一輪PCR得到了彌散條帶 (見圖1A)，隨后以第一輪PCR擴增產物為模板，進行第二輪巢式PCR，各得到一條清晰的條帶 (見圖1B，C)，3′擴增得到783 bp片段，5′擴增得到402 bp片段。將第二次的條帶回收，連接到pMD19-T載體，并克隆測序。將三個測序片段拼接后得到含有完整ORF的全長cDNA序列，其5′非翻譯區(UTR)為338 bp，3′ UTR為376 bp (包含28個polyA尾)，開放閱讀框(ORF)1110 bp，推測編碼369個氨基酸。為進一步驗證拼接序列的可靠性，根據拼接的ORF序列，設計LD-PCR引物，結果擴增出了1110 bp的特異條帶 (見圖1C)，測序結果與拼接序列完全一致。將該基因命名為AsMAPK3，GenBank 登錄號為KR 092345。

注：A：第一輪PCR擴增產物；B，C：第二輪巢式PCR擴增產物；D：LD-PCR產物 M1：DNA Marker2000；M2：DNA Marker5000；1和2：3′/5′-RACE 第一輪PCR擴增產物；3：3′-RACE 第二輪PCR擴增產物；4：5′-RACE第二輪PCR擴增產物；5：全長基因LD-PCR產物圖1 AsMAPK3基因的3′/5′-RACE擴增結果

2.2AsMAPK3的生物信息學分析

2.2.1 AsMAPK3蛋白的理化特性分析 利用ExPASy Proteomics Server的在線軟件Protparam (http：//www.expasy.org/tools/protparam.html) 對As MAPK3蛋白的理化性質進行預測分析。推測其分子式為C1902H2956N520O555S19，分子量為42.597 kD，帶正電殘基 (Arg+Lys) 為37，負電殘基 (Asp+Glu) 為51，脂肪系數為90.38，等電點pI 5.42，該蛋白的不穩定系數為41.15，為不穩定性蛋白，平均親水性系數為-0.292，預測該蛋白為親水蛋白。

2.2.2 跨膜區、信號肽及亞細胞定位預測 TRMHMM server v2.0跨膜預測AsMAPK3編碼的蛋白沒有跨膜結構域，為胞外蛋白。SignalP 4.1 Server預測結果顯示AsMAPK3蛋白為非分泌蛋白，不具有信號肽。亞細胞預測定位結果表明該蛋白定位在細胞核中。

2.2.3 功能域及位點分析 利用在線InterProScan軟件對AsMAPK3蛋白的結構功能特點進行分析顯示，37-331為蛋白激酶結構域；43-67位氨基酸為ATP結合位點；72-175位為MAPK保守結構域；159-171位為絲氨酸/蘇氨酸活性位點。

2.2.4 AsMAPK3氨基酸序列的分子系統進化分析 利用NCBI在線BlastP工具，將AsMAPK3與GenBank 中其他植物的MAPK3蛋白進行比對，并通過MEGA 4軟件采用相鄰連接法構建MAPK3進化樹，進行聚類關系分析。結果如圖2所示，MAPK3蛋白具有高度保守性，都含有MAPK家族保守的功能域GAYGIVC和MTEYVV，與棉花(Gossypiumarboreum)、可可(Theobromacacao)、巨桉(Eucalyptusgrandis)和甜橙(Citrussinensis)的同源性達92%。圖3所示為13個植物物種及來自人腦和小鼠肌肉的MAPK3的系統發育樹，AsMAPK3與甜瓜(Citrusmelo)，巨桉(Eucalyptusgrandis)在一個分支，說明在所選蛋白中二者的親緣關系最近，在功能上也可能類似。另外，聚類圖明顯將植物來源和動物來源的MAPK3家族分為兩個大的分支，說明二者親緣關系較遠。植物的13個MAPK3蛋白家族聚為一個大的分支，親緣關系較近；而小鼠和人的MAPK3蛋白聚為另外一個分支，二者親緣關系較近。

圖2 AsMAPK3與其他植物來源的4個MAPK3的氨基酸序列比對

圖3 AsMAPK3與來源其他植物的12個MAPK3及來自人腦和小鼠肌肉組織的MAPK3的分子系統發育樹

2.3AsMAPK3基因的組織表達特異性分析

利用實時熒光定量PCR檢測AsMAPK3基因的組織表達特異性，結果表明該基因在葉中的表達量最高，其次是莖、根，花中的表達量最低 (見圖4)，說明AsMAPK3可能主要在葉中發揮生物學功能，參與植物的生長發育。另外，白木香莖桿和根是沉香合成的主要部位，推測AsMAPK3除了對調控植物的生長發育起重要作用外，還可能參與調控沉香倍半萜的生物合成。

圖4 AsMAPK3基因在組織中的表達情況

2.4AsMAPK3基因響應不同傷害處理的表達特性分析

健康的白木香只有受到外界傷害后才能產生沉香類物質。茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)是植物對外界傷害(機械傷害、蟲咬等)和病原菌侵染做出反應而誘導抗性基因表達的信號分子[18-19]。為了研究AsMAPK3基因的表達是否受這兩個激素的調節，本實驗采用熒光定量PCR的方法對AsMAPK3在二種激素處理下不同時間點的表達量進行了分析 (見圖5)。結果表明，AsMAPK3主要受MeJA處理的誘導，6 h 時達到最高表達水平，36 h下降到正常狀態表達水平；AsMAPK3的表達受SA對影響較小，處理12 h后升高2倍，24 h后逐漸下降，至36 h表達量反而受到抑制，只有正常表達水平的一半。

圖5 AsMAPK3響應MeJA和SA處理的表達特性

3 討論

蛋白激酶是植物體內一類重要的調節酶，而促分裂原活化蛋白激酶MAPK廣泛存在于各種真核生物體內，是一類絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶。它與上下游一些信號分子組成MAPK級聯信號通路，在植物生長發育及響應各種生物和非生物脅迫過程中發揮重要作用[8-10]。研究表明，MAPK的活化是植物感知外界傷害的最早期信號反應之一[20-23]。

白木香是典型的誘導型藥用植物，只有受到外界傷害時才能啟動相應的代謝途徑合成倍半萜等沉香類物質。本研究首次從白木香中克隆了AsMAPK3基因，并對其表達特性進行了初步分析。AsMAPK3具有MAPK蛋白家族的保守結構域和典型的激酶特性，推測其可能與其他物種的MAPK3具有相似的生物學功能。擬南芥基因組中共有20個MAPK基因，但MPK3、MPK4和MPK6是協調各種防御反應(包括植保素誘導和防御基因的激活)的最重要的三個MAPKs[24]。AsMAPK3與擬南芥中MPK3同源性最高，其次是MPK6和MPK4，暗示AsMAPK3可能參與傷害誘導白木香發生的防御反應。JA是植物防御反應應答和次生代謝物質積累的重要信號分子，在白木香誘導結香中扮演重要角色[4，25]，本研究中qRT-PCR的結果表明，AsMAPK3的表達受JA誘導顯著，6 h達到峰值，之后逐漸下降至36 h恢復正常水平，說明AsMAPK3屬于傷害早期響應基因。但其轉錄水平對SA處理幾乎不響應。這與JA和SA對沉香誘導形成的效果相一致[4，25]。推測AsMAPK3可能在JA介導的信號途徑中參與調控沉香倍半萜的形成。另外，組織表達的結果顯示，AsMAPK3主要在葉片中表達，其次是在根莖中。說明AsMAPK3除了在傷害誘導的防御反應中參與誘導白木香結香過程，還參與調控植物正常生長發育。本研究為進一步研究AsMAPK3蛋白的功能奠定了基礎，對探明其參與傷害信號轉導以及調控傷害誘導沉香形成的分子機制具有重要意義。但是，AsMAPK3究竟在沉香形成的過程發揮怎樣的作用，與信號通路中其他蛋白如何相互作用等機制有待更深入的探討。

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CloningandExpressionAnalysisofAsMAPK3fromAquilariasinensis(Lour.)Gilg

XU Yanhong1，TIAN Meihui1，3，SUN Peiwen1，GAO Zhihui1，JIN Yue1，WEI Jianhe1，2*

(1.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Ministry of Education & National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；2.Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine & Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Agarwood Sustainable Utilization，Hainan Branch of the Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Haikou 570311，China；3.Northeast Forestry University，Harbin 150040)

Objective：To clone a mitogen-activated protein kinase (MAPK) gene fromAquilariasinensis(Lour.) Gilg，and to analyze its expression profiles in different tissues and inducers.Methods：Rapid amplification of cDNA ends (RACE) technology was used to clone the full-length cDNA of the MAPK gene on the basis of its partial cDNA sequence obtained from our previous 454-sequenced dataset.Using NCBI online Blastp，DNAman and MEGA4，the sequences were bioinformatically analyzed.After that，its expression profiles in different tissues and inducers were analyzed by real-time PCR.Results：The MAPK gene，AsMAPK3 was cloned fromA.sinensisand its expression profiles were analyzed.Conclusion：Our works on gene cloning and expression analysis provide a substantial foundation for follow-up biofunction analysis of theAsMAPK3.

Aquilariasinensis；sesquiterpene；MAPK；expression analysis

國家自然科學基金項目 (81573525，81673549)；海南省重大科技計劃項目(ZDKJ2016004)；中組部“萬人計劃”(99950534)

] 魏建和，研究員，博士生導師，研究方向：藥用植物基因資源、分子育種及次生代謝產物調控研究；Tel：010-57833016，E-mail：wjianh@263.net

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.006

2017-05-29)

*[