22個白木香倍半萜合酶(AsTPS)基因的健康與傷害誘導表達特性研究△

呂菲菲，孫佩文，劉培衛，李俊，徐艷紅*，魏建和，*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所(中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，瀕危藥材繁育國家工程實驗室)，北京 100193；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護與開發重點實驗室，國家中醫藥管理局沉香可持續利用重點研究室)，海南 海口 570311；3.海南省食品藥品檢驗所五指山分所，海南 五指山 572200)

·專題·

22個白木香倍半萜合酶(AsTPS)基因的健康與傷害誘導表達特性研究△

呂菲菲2，孫佩文1，劉培衛2，李俊3，徐艷紅1*，魏建和1，2*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所(中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，瀕危藥材繁育國家工程實驗室)，北京100193；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護與開發重點實驗室，國家中醫藥管理局沉香可持續利用重點研究室)，海南 海口570311；3.海南省食品藥品檢驗所五指山分所，海南 五指山572200)

目的：明確22個AsTPS基因在健康和傷害白木香中的表達情況，篩選出催化沉香倍半萜合成的關鍵酶基因。方法：全斷法傷害處理白木香，常規PCR和熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測基因表達情況。結果：22個As-TPS基因中，1個基因在健康和傷害白木香中均不表達；3個基因在健康白木香中不表達，但明顯響應于外界傷害；18個基因在健康白木香中均有一定量表達，而傷害處理后，其中7個基因相對表達量達數千倍，11個基因雖也被誘導表達，但相對表達量僅達幾十倍至幾百倍。結論：21個As-TPS基因為傷害誘導型基因，其中3個是沉香倍半萜合成的關鍵催化酶基因；在傷害誘導后含量急劇表達上升的7個As-TPS是白木香傷害誘導結香早期倍半萜合成的重要催化酶。

沉香，白木香，倍半萜合酶，傷害誘導，基因表達

沉香(LignumAquilarizeResindum)為瑞香科沉香屬或擬沉香屬植物含樹脂的木材，是樹體受傷后分泌出來的油脂成分和木質成分的固態凝聚物[1]。經研究證實沉香的主要藥用成分為倍半萜類和色酮類化合物，且健康的白木香中不能形成這些物質，樹體只有受到各種外界刺激(物理、化學傷害或真菌侵染)后才能產生[2，3]。倍半萜合酶是倍半萜類化合物合成的關鍵催化酶，在其生化合成的最后催化階段發揮著舉足輕重的作用[4]。

倍半萜合酶的含量和活性是催化倍半萜類物質產生的前提，主要受基因轉錄水平調控[5-6]。外界生物與非生物因素脅迫誘導，可引起細胞內信號分子響應，傳遞信號給轉錄因子，導致基因轉錄水平的變化，增強或減弱倍半萜合酶基因表達，其具有明顯的誘導表達特性[5]。研究已證實，AsTPS中AsASS1，AsASS2基因在健康白木香中表達水平極低，幾乎不表達，但傷害或MeJA處理后明顯被誘導表達[7]。基因表達特性研究發現，AsASS1，AsASS2表達積累與沉香倍半萜誘導合成具有一致性，同時AsASS1體外催化實驗證實其催化產物為沉香倍半萜主要成分[8-9]，可見，AsTPS是沉香倍半萜合成的關鍵催化酶。但往往因為取樣傷害會造成一定的實驗誤差，不能確定AsTPS基因在健康白木香中的表達情況，此外，AsTPS種類較多，催化合成的倍半萜成分多樣，很難確定發揮關鍵作用的酶。因此本研究在縮短取樣時間的基礎上，對包括AsASS1在內的22個AsTPS在健康和傷害白木香中進行基因表達分析，明確AsTPS基因在健康白木香中的表達情況，同時傷害響應表達檢測篩選出關鍵催化酶基因。本研究有助于解釋在健康白木香中不合成沉香倍半萜而傷害脅迫后沉香倍半萜大量合成的生理調控機制，對沉香形成分子機制研究具有重大的推動意義。

1 材料與方法

1.1材料

栽培三年生的白木香(Aquilariasinensis)取自海南省海口市美蘭區演豐沉香基地，經魏建和研究員鑒定為瑞香科(Thymelaeceae)沉香屬(Aquilaria)白木香(A.sinensis)，樹高1m，樹干直徑1.0cm，生長健壯，對其莖干進行全斷干法物理傷害處理，并在0h和2h后取樣(時間控制在2～3s內)，立即投入液氮中速凍，-80℃保存備用。

22個倍半萜合酶基因序列均由白木香轉錄組測序比對和注釋獲得。

1.2白木香莖干總RNA提取和cDNA合成

三年生白木香莖干經物理傷害處理與健康材料用液氮冷凍研磨成粉，依據植物 RNA 提取純化試劑盒 EASY-spin plus RN38(Aidlab，China)說明書提取總RNA；利用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA完整性，分光光度計Nano Drop2000C (Thermo Scientific，USA) 測定所提取RNA濃度。

取約500ng 所提取的RNA，以MMLV (TaKaRa)為逆轉錄酶，以Oligod(T)18(TaKaRa)為引物，d NTP Mix (TaKaRa)為原料，反轉錄合成cDNA 第一鏈，作為qRT-PCR的模版。1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA的合成完整性，分光光度計Nano Drop2000C (Thermo Scientific，USA) 測定cDNA濃度。

1.3PCR檢測基因表達

根據白木香轉錄組測序比對和注釋的22個AsTPS基因序列，利用Primer5.0軟件設計特異性引物(表1)，由上海生工合成；

常規PCR擴增反應體系：模板cDNA1ug，正反向引物均為1ul，2*Taq mix酶(TaKaRa)1ul，加水補至10ul反應體系；運用Bio-Rad T100梯度PCR儀進行擴增，PCR擴增程序：95℃5min；95℃15s，根據不同基因引物退火溫度設定(表1)30s，72℃30s，30個循環；72℃10min。1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測基因擴增結果。

熒光定量PCR檢測基因表達量：儀器采用Bio-Rad的 iQTM5實時熒光定量PCR 檢測系統，擴增體系為2×SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa)10μL； 正反向引物濃度均為1μL；c DNA 模板1μL；加超純水補足至20μL。實時 PCR 擴增程序如下：95℃10min；95℃10s；退火根據不同基因引物退火溫度設定(表1)15s，延伸72℃20s，40個循環。所有PCR反應均以三磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH) 為內參[10]，將Real-time PCR所得的樣品Ct 值，利用2-ΔΔCt方法轉化為基因相對表達量值。

表1 As-TPS基因PCR擴增所使用的特異性引物(primer 5.0 軟件設計)

檢測結果使用SPSS數據統計軟件進行單樣本t-test顯著性檢測分析，每個反應體系單獨重復實驗3次。

2結果與分析

通過常規PCR擴增和qRT-PCR檢測22個AsTPS基因在健康和傷害白木香中的表達情況(表2)，根據健康白木香中表達情況大致可歸為兩類：(1)健康白木香中不表達的基因；(2)健康白木香中有一定量表達的基因。

表2 22個AsTPS基因在健康白木香樹中的本底與傷害誘導表達情況

2.1健康白木香中不表達的基因

健康白木香中AsTPS-10，AsTPS-16，AsTPS-19(AsASS1)基因經PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測沒有發現相對應的擴增條帶；但傷害處理2h后出現了相對應的基因擴增條帶，其表達量明顯上升(見圖1)。說明這三個基因在健康白木香中不表達，但傷害誘導后會被激活，此結果與沉香倍半萜在健康白木香中不產生，而受傷害誘導合成的合成方式一致，所以這三個AsTPS是沉香倍半萜傷害誘導合成的關鍵催化酶。此外，檢測發現AsTPS-9在健康和傷害白木香中均無表達，說明此基因在健康白木香中沉默，同時也不響應于植物的傷害誘導，其對白木香傷害誘導結香沒有催化作用。

注：H：healthy；W：wound圖1 健康白木香中沉默基因表達情況

2.2健康白木香中有所表達的基因

常規PCR和qRT-PCR共同檢測18個AsTPS基因表達，發現其中7個基因(AsTPS-6，AsTPS-11，AsTPS-12，AsTPS-13，AsTPS-14，AsTPS-17，AsTPS-18)在健康白木香中都有微弱表達，傷害后其表達量會急劇增加，短短2h內高達數千倍(見圖2)，這些基因明顯受到傷害誘導，且對傷害刺激響應較為強烈，活性明顯增強，可能是結香早期倍半萜合成的主要催化酶。

其他11個AsTPS基因經檢測發現，健康白木香中也都有微弱表達，同時傷害誘導后其表達量也會上升，但是相對誘導表達倍數較前7個基因(相對誘導數千倍表達)弱一些，只達到十幾到幾百倍(見圖3)，它們可能對傷害誘導早期沉香倍半萜的合成具有一定的響應和催化作用，但不發揮主導作用。

綜上，從白木香轉錄組測序比對到的22個AsTPS基因，除AsTPS-9外，均屬于誘導型基因，且都響應于外界傷害刺激，對傷害誘導倍半萜合成都具有一定的催化作用，但每個AsTPS基因在健康白木香中的本底表達和傷害情況下的誘導響應特點各不相同，需要進一步的具體探索，尤其應針對響應傷害誘導劇烈的關鍵酶基因展開研究；并且從檢測到的AsTPS表達模式也可以說明：倍半萜類物質是白木香傷害誘導的產物，本研究即從AsTPS基因轉錄表達的角度進一步證實本課題組前期提出的白木香“防御反應結香假說”。

注：H：healthy；W：wound 圖2 對傷害刺激早期響應強烈的AsTPS基因表達情況

3 討論

倍半萜類物質是沉香的主要成分之一，其在健康白木香中不存在，只有樹體受到外界傷害才會誘導合成[1，3]。倍半萜的合成是一種復雜的生理生化過程，需要多種酶類的催化和輔助，其中倍半萜合酶作為倍半萜類物質骨架形成的直接催化作用酶，對倍半萜的合成具有不可替代的催化作用[11，12]。倍半萜合酶的活性主要受基因表達調控，本研究檢測發現白木香22個AsTPS基因在健康白木香中沉默或微弱表達，而傷害誘導后21個基因的表達都會有所上升，說明AsTPS的活性是受傷害誘導調控的，此結果與前期課題組基因克隆的AsTPS基因表達特性[8-9]一致，并更全面的檢測了其他倍半萜合酶基因，進一步證明了AsTPS活性增強是外界植物傷害刺激的防御反應結果，與沉香倍半萜傷害誘導合成方式一致，間接證實了白木香“防御反應結香假說”[1]。

沉香倍半萜種類較多，而倍半萜合酶的催化特性具有專一性，即一種酶可催化合成一種或幾種倍半萜類物質[13]，本課題對22個As-TPS基因的傷害誘導表達檢測發現其在白木香中個體表達模式存在較大差異，AsTPS-10，AsTPS-16，AsTPS-19健康白木香中不表達，傷害誘導后表達量明顯升高(見圖1)，這些基因可能對沉香倍半萜被誘導合成的關鍵催化作用，由于其在健康白木香中不表達，所以健康白木香中相應的檢測不到倍半萜含量，該類酶的深入研究可很好地闡述沉香形成機制。前期研究發現植物倍半萜合成具有一定的時序性，即植物會在不同生長期或不同響應誘導時期合成不同的倍半萜成分，且受不同倍半萜合酶的催化[14，15]。研究發現，有18個AsTPS基因在健康白木香中微弱表達，含量極低不足以催化倍半萜合成，其中AsTPS-6，AsTPS-11，AsTPS-12，AsTPS-13，AsTPS-14，AsTPS-17，AsTPS-18傷害誘導后表達量會急劇上升，短時間內誘導表達上千倍，含量變化較大(見圖2)，說明它們響應于早期的傷害誘導，對沉香倍半萜早期合成起催化作用。故在白木香中此類AsTPS的研究可以很好地分析傷害誘導結香早期倍半萜成分的變化，對研究白木香防御反應啟動和沉香形成具有關鍵指導意義；其他11個AsTPS基因也響應于白木香的傷害誘導，但在短期內其表達量上升幅度相對較弱(見圖3)，說明此類基因對沉香倍半萜合成也具有一定的催化作用，但對早期沉香倍半萜的合成催化作用較弱，可能對中后期沉香形成起催化作用，但需要后續進一步研究分析。

本文研究證實，AsTPS的傷害誘導表達是沉香倍半萜合成的關鍵機制，其對沉香倍半萜合成是不可或缺的，但其種類較多，催化合成的倍半萜組分也較多樣化，故還需對篩選出的關鍵調控基因進一步深入研究。本文將對研究沉香倍半萜多成分原因及合成的調控機制奠定基礎。

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StudyonBackgroundandWoundInducedExpressionof22SesquiterpeneSynthaseGenesofAquilariasinensis

LV Feifei2，SUN Peiwen1，LIU Peiwei2，LI Jun3，XU Yanhong1，*，WEI Jianhe1，2*

(1.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Ministry of Education & National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China2.Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine & Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Agarwood Sustainable Utilization，Hainan Branch of the Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Haikou 570311，China3.Wuzhishan branch of Food and Drug inspection of Hainan，Wuzhishan，572200，China)

Objective：TO confirm the expression mode of 22 sesquiterpene synthase in healthy and woundAquilariasinensis，and selected the key enzymes for catalyzing agarwood sesquiterpene synthesis.Methods：The branch ofA.sinensiswere treated by all broken method，the gene expression was tested by PCR and qRT-PCR.Results：1 gene expressed neither in the healthy nor wound trees.3 genes were silenced in healthey trees，but were obviously response to the external stimuli.Other 18 genes expressed in healthy samples among which 7 genes expression increased rapidly and the relative expression level was thousands of times and 11 genes also were induced to express but the relative expression level was dozens to hundreds times in short time after trees were wounded.Conclusion：21 sesquiterpene synthase genes are induced-genes and catalyze synthesis of agarwood sesquiterpenes.Among of them，3 enzymes are the pivotal enzymes for catalyzing sesquiterpene synthesis and 7 enzymes are the key enzymes for sesquiterpene synthesis in early period of agarwood formation in woundA.sinensis.

Agarwood，Aquilariasinensis，sesquiterpene synthase，wound-induce，gene expression

國家自然科學基因項目(NO.：81673549)，海南省重大科技計劃項目(ZDKJ2016004)；海南省自然科學基金(NO.20163150)

] 徐艷紅，博士，副研究員，研究方向：藥用植物次生代謝調控研究，Tel：010-57833363，E-mail：xuyanhong99@163.com；魏建和，研究員，博士生導師，研究方向：藥用植物基因資源與分子育種及次生代謝產物調控研究，Tel：010-57833016，E-mail：wjianh@263.net

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.005

2017-05-31)

*[