封閉式薄片法在睪丸單精子冷凍保存中的應用探索

馬超+胡明廣+金波

[摘要]目的 探討封閉式薄片法對梗阻性無精子癥（OA）患者睪丸單精子的冷凍效果，以期為非梗阻性無精子癥（NOA）患者單精子冷凍保存提供一種簡單有效的方式。方法 選取2016年6～12月在大連市生殖與遺傳醫學中心診斷為OA 15例患者作為研究對象，應用封閉式薄片法冷凍方式對睪丸單精子進行冷凍保存。睪丸冷凍精子解凍復蘇后（冷凍組），對體外成熟（IVM）卵子行卵胞漿內單精子顯微注射技術（ICSI），統計其受精率與卵裂率，并與睪丸新鮮精子（新鮮組）ICSI進行比較，以期對睪丸單精子解凍后受精能力進行評估。冷凍組及新鮮組精子均來自上述15例患者。結果 應用封閉式薄片法對睪丸單精子進行冷凍，解凍后具有很高的精子回收率與存活率（92.00%，65.94%）。冷凍組與新鮮組具有相似的受精率（56.00% vs. 70.66%）和卵裂率（97.44% vs. 95.83%），兩組差異無統計學意義（P>0.05）。結論 封閉式薄片法玻璃化冷凍方式可有效保存OA患者睪丸單精子，且精子復蘇后具有較高的受精能力，為NOA患者單精子冷凍保存應用于臨床奠定了實驗基礎。

[關鍵詞]睪丸單精子；冷凍保存；無精子癥；回收率

[中圖分類號] R321.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）08（c）-0019-04

[Abstract]Objective To investigate the effect of Closed-Sheet Method on testicular spermatozoa in patients with obstructive azoospermia（OA），in order to provide a simple and effective cryopreservation for individual numbers of testicular spermatozoa in patients with non-obstructive azoospermia（NOA）.Methods 15 patients were diagnosed with OA by Reproductive Medicine & Genetic Center of Dalian from June to December 2016.Single testicular spermatozoa was frozen with Closed-Sheet Method，and we compared cleavage rate and fertility rate after ICSI between frozen-thawed individual numbers of testicular spermatozoa and fresh testicular sperm with abandoned in vitro maturation of immature oocytes，and the fertilization rate of frozen-thawed testicular spermatozoa was evaluated.Both frozen and fresh groups were from the above 15 patients.Results The frozen-thawed individual numbers of testicular spermatozoa had higher recovery rate and viability rate（92.00%，65.94%） with the Closed-Sheet Method.The fertility rate （56.00% vs 70.66%）and cleavage rate （97.44% vs 95.83%） of frozen testicular spermatozoa was similar to fresh testicular sperm after ICSI，and no significant difference（P>0.05）.Conclusion Since the frozen-thawed testicular spermatozoa had a higher ability of fertilization.The Closed-Sheet Method was effective to cryopreserve individual numbers of testicular spermatozoa in patients with OA.This study laid the experimental basis for the clinical application of single sperm cryopreservation in patients with NOA.

[Key words]Individual numbers testicular spermatozoa；Cryopreservation；Azoospermia；Recovery rate

隨著Bung等[1]1953年成功對人類精子進行冷凍保存，精子冷凍技術在當今發展已趨于成熟，可作為不孕不育患者的一種常規輔助生育手段。然而對于無精子癥患者睪丸精子的冷凍保存，尤其是對非梗阻性無精子癥（nonobstructive azoospermia，NOA）患者來說，采用常規精液冷凍保存技術往往不能達到滿意的效果[2]。為了避免取卵日因睪丸取精失敗而取消周期，同時避免反復睪丸活檢對睪丸功能的損傷，對睪丸微量精子甚至單精子進行冷凍保存具有重要意義。在筆者以往的研究中，應用封閉式薄片法對正常精液標本微量精子進行冷凍并取得成功[3]。本研究進一步將此方法運用到OA患者睪丸單精子的冷凍保存中，觀察解凍后精子的相關指標以及受精能力，以期為NOA患者單精子冷凍保存應用臨床打下實驗基礎。endprint

1資料與方法

1.1研究對象

選取2016年6～12月在本中心男科門診接受睪丸活檢的15例OA患者作為研究對象，活檢后剩余精子作為研究標本。其中2例有睪丸炎病史，其余均為原因不明的無精子癥。OA的診斷標準為3次射出精液離心沉淀后未見到精子，經皮睪丸精子抽吸術（testicular spermextraction，TESA）后，均可見精子。所有患者染色體檢查均為46，XY（3例小Y，1例大Y），性激素測定均在正常范圍之內。體外成熟（in vitro maturation，IVM）卵子來源于同期卵胞漿內單精子顯微注射技術（ICSI）周期。本研究經大連市婦女兒童醫療中心倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1 TESA精子獲取 若采卵日（ICSI）周期獲取未成熟卵子較多（大于10枚），告知男科醫師次日上午行TESA活檢術，活檢標本（新鮮組）部分直接用與IVM卵子ICSI；部分冷凍保存，日后解凍（冷凍組）用于IVM卵子ICSI?；顧z具體步驟如下：常規皮膚消毒，用5 ml注射器吸入少量培養液后經陰囊皮膚穿刺刺入睪丸，抽吸針管獲得少許睪丸組織，將睪丸組織送實驗室檢查，解剖顯微鏡下用1 ml注射器撕碎分開生精小管，G-MOPS-plus（Vitrolife）中清洗2遍，盡量多地去除紅細胞，然后用吸管反復吹打混勻，吸入離心管，混懸液1000 r/min離心5 min，留取沉淀，培養箱中孵育后備用。

1.2.2冷凍載體的制備 冷凍載體是由手工裁剪聚丙烯薄片和常規精子冷凍管組成。具體構造見文獻[3]。

1.2.3睪丸精子冷凍及復蘇 ①冷凍前準備：注射皿（BD FALCON 1006）中做好50 μl長條液滴，礦物油覆蓋，巴斯特吸管吸取約5 μl的離心后沉淀，加入液滴下端，置于37℃預溫5 min。②冷凍過程：使用顯微操作系統（RI-Integra Ti）從精子微液滴中吸取10根活力較好精子，冷凍薄片置于100 mm皿（BD FALCON 3003）中，用移液槍將1.0 μl含10%人血清清蛋白的HEPES緩沖液加在冷凍薄片前段，同時快速將注射針落入冷凍微滴中，并將吸入精子注入微液滴中，立即用無菌鑷子將冷凍薄片夾入精子冷凍管中，旋緊螺帽，液氮上方1 cm熏蒸2 min，隨即投入液氮中保存。③復蘇前準備：將3 ml礦物油倒入培養皿中（BD FALCON 3001），置于37℃培養箱中預溫備用。④復蘇過程：將精子冷凍管從液氮中取出，旋開螺帽，用鑷子將冷凍薄片夾出，迅速浸入37℃礦物油中復蘇。37℃培養箱中孵育5 min，隨即可對復蘇后精子進行評估。

1.2.4精子復蘇后相關指標評估 解凍復蘇后對精子回收率、活動率及存活率進行評估。具體評估方式如下：精子回收率=回收精子數/冷凍精子數；精子活動率=（前向運動精子數+非前向運動精子數）/回收精子數；精子存活率（低滲腫脹實驗）=尾部卷曲精子數/回收精子數。

1.2.5超促排卵及卵子的獲取 超促排卵采用超長方案、長方案和短方案[4]，當有≥2個優勢卵泡直徑20 mm時，注射絨毛膜促性腺激素（HCG）10 000 IU，36 h后行陰道B超引導下穿刺取卵術。

1.2.6 IVM卵子收集、受精及卵裂情況 對采卵首日ICSI周期獲取卵子行剝除顆粒細胞后，一旦發現MI期或GV期卵子，轉移至G-IVF-plus（Vitrolife）培養液中過夜培養，次日上午觀察極體排出情況，若發現第一極體排出，則可用于ICSI。冷凍組精子選擇：解凍后挑選形態正?；顒踊虿粍泳有蠭CSI，不動精子經低滲腫脹實驗后，選取尾部卷曲精子行ICSI。新鮮組精子選擇：挑選形態正常活動精子行ICSI。ICSI具體步驟按本中心常規操作。ICSI后16～18 h觀察受精情況，正常受精標準為雙原核（2PN）出現。ICSI后40～42 h觀察卵裂情況，2細胞以上視為發生卵裂。

1.3統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件對數據進行分析，計數資料以率表示，比較采用χ2檢驗分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1睪丸單精子冷凍復蘇后相關指標

15例患者TESA后均見活動精子，睪丸單精子冷凍解凍后回收率、活動率與存活率分別為92.00%（138/150）、16.67%（23/138）、65.94%（91/138）。

2.2兩組ICSI結果的比較

兩組受精率、2PN率和卵裂率差異均無統計學意義（P>0.05）（表1）。

3討論

ICSI技術結合顯微外科取精術解決了大多數男性無精子癥患者的生育問題，但對NOA患者來說，首次手術取精成功后，再次取精仍然有30%失敗風險[5]，因此對第一次活檢找到的微量睪丸精子進行冷凍保存，顯得十分必要。雖然人類精子冷凍技術在1953年經Bung等[1]研究獲得成功，并已經在輔助生殖技術中常規開展，但對來自NOA患者的睪丸精子，因為獲取數量少，精子活力低，且精子成熟度差等原因，常規精液冷凍保存技術往往無法達到凍存要求。因此，找到一種合適的冷凍方法對微量精子甚至是單精子進行冷凍保存，已經成為輔助生殖技術中的一個函待解決的問題。

隨著玻璃化冷凍技術的發展與完善，人們逐漸認識到可通過玻璃化冷凍方式對精子進行冷凍和復蘇[6-9]?，F有研究資料顯示，國內外研究者采用空透明帶冷凍法[10]、冷凍環法[11]、微麥管法[12]、ICSI針法[13]、冷凍薄膜及Cell sleeper法[7]，極體活檢針法[14]等方式對微量精子進行冷凍保存。根據冷凍方法不同，精子復蘇后回收率可達59%～100%，存活率可達8%～85%[14]。但上述方法由于可操作性差和儲存安全性低等原因，很難常規在臨床上開展應用。我們過去嘗試應用封閉式薄片法對正常精液標本單精子進行冷凍并取得成功[3]，大大改善了冷凍可操作性和儲存安全性，并獲得了較高的精子回收率與存活率。同時比較了冷凍保護劑與無冷凍保護劑對微量精子的冷凍效果，結果顯示，二者具有相似的冷凍效果。本研究進一步將此方法運用到睪丸單精子的冷凍保存中，采用無冷凍保護劑玻璃化冷凍的方式，同樣獲得了較高的精子回收率和存活率。endprint

值得注意的是，睪丸精子解凍復蘇后活動率極低，基本無前向運動精子，活動精子均表現為尾巴偶爾輕輕擺動，需在鏡下仔細長時間觀察方可發現。究其原因，首先由于睪丸精子未經過在附睪的進一步成熟過程，精子細胞膜尚未完全成熟，抗凍能力較差。其次，通過TESA獲得的睪丸組織混有少量血細胞和大量死亡精子碎片等雜質，且睪丸精子缺少精漿的保護，導致其易造成冷凍損傷，解凍后活動能力下降。

近來國內外文獻報道傳統方式冷凍睪丸精子解凍后行ICSI能取得與新鮮睪丸精子相似的受精率及臨床妊娠率[15-16]。但國內外對睪丸單精子冷凍解凍后ICSI結局報道較少，Walmesly等[10]和Endo等[7]成功對睪丸單精子進行冷凍保存，并獲得了較高的受精率與卵裂率。本研究結果顯示，應用封閉式薄片法冷凍睪丸單精子，精子解凍后仍然具有較高的受精能力，與睪丸新鮮組比較后發現，冷凍組受精率雖然低于新鮮組，但兩組受精率和卵裂率差異無統計學意義，我們的實驗結果與國外報道基本一致。

此外，由于睪丸單精子冷凍復蘇后多數為不動精子，如何選擇不動精子行ICSI對臨床結局尤為重要。應用睪丸不動精子行ICSI的臨床應用國內外均有報道[7，17-18]，本研究通過選擇正常形態的活動精子直接行ICSI，或不動精子經低滲腫脹實驗后選取尾部卷曲精子行ICSI的方式對IVM卵子進行注射，獲得了較高的受精率和卵裂率。

本研究初步探討了封閉式薄片法在睪丸單精子冷凍中應用的可行性。由于NOA患者精子獲取困難且非常珍貴，故本研究嘗試用OA患者睪丸精子作為實驗標本，應用封閉式薄片法玻璃化冷凍方式進行冷凍，復蘇后獲得較高的精子回收率與存活率，并取得了與新鮮睪丸精子相似的受精率與卵裂率。雖然OA患者的精子質量不能等同于NOA患者，但本研究結果為日后NOA患者單精子冷凍保存應用于臨床奠定了實驗基礎。

[參考文獻]

[1]Bunge RG，Sherman JK.Fertilizing capacity of frozen human spermatozoa[J]. Nature，1953，172（4382）：767-768.

[2]Schuster TG，Keller LM，Dunn RL，et al.Ultra-rapid freezing of very low numbers of sperm using cryoloops[J].Hum Reprod，2003，18（4）：788-795.

[3]馬超，胡明廣，王贊滔，等.封閉式薄片法對人類微量精子超快速玻璃化冷凍的研究[J].現代婦產科進展，2015，24（10）：762-764.

[4]陳子江.人類生殖與輔助生殖[M].北京：科學出版社，2005：373-460.

[5]Abdel Raheem A，Rushwan N，Garaffa G，et al.Factors influencing intracytoplasmic sperm injection （ICSI） outcome in men with azoospermia[J].BJU Int，2013，112（2）：258-264.

[6]Isachenko V，Isachenko E，Petrunkina AM，et al.Human spermatozoa vitrified in the absence of permeable cryoprotectants：birth of two healthy babies[J].Reprod Fertil Dev，2012，24（2）：323-326.

[7]Endo Y，Fujii Y，Kurotsuchi S，et al.Successful delivery derived from vitrified-warmed spermatozoa from a patient with nonobstructive azoospermia[J].Fertil Steril，2012，98（6）：1423-1427.

[8]Nawroth F，Isachenko V，Dessole S，et al.Vitrification of human spermatozoa without cryoprotectants[J].Cryo Letters，2002， 23（2）：93-102.

[9]靳鐳，鄭家鳳，劉群，等.微滴無保護劑玻璃化法冷凍附睪微量精子的研究[J].中華男科學雜志，2010，16（12）：1089-1094.

[10]Walmsley R，Cohen J，Ferrara-Congedo T，et al.The first births and ongoing pregnancies associated with sperm cryopreservation within evacuated egg zonae[J].Hum Reprod，1998，13（Suppl 4）：61-70.

[11]Desai NN，Blackmon H，Goldfarb J.Single sperm cryopreservation on cryoloops： an alternative to hamster zona for freezing individual spermatozoa[J].Reprod Biomed Online，2004，9（1）：47-53.

[12]Isachenko V，Isachenko E，Montag M，et al.Clean technique for cryoprotectant-free vitrification of human spermatozoa[J].Reprod Biomed Online，2005，10（3）：350-354.

[13]Sohn JO，Jun SH，Park LS，et al.Comparison of recovery and viability of sperm in ICSI pipette after ultra rapid freezing or slow freezing[J].Fertil Steril，2003，80：128.

[14]Kuznyetsov V，Moskovtsev SI，Crowe M，et al.Vitrification of a small number of spermatozoa in normozoospermic and severely oligozoospermic samples[J].Syst Biol Reprod Med，2015，61（1）：13-17.

[15]鄶艷榮，賀占舉，蔡學泳，等.凍存睪丸精子用于男性生殖力儲備的探討[J].中華男科學雜志，2012，18（3）：231-234.

[16]Levron J，Madgar I，Shefi S，et al.IVF outcome with cryopreserved testicular sperm[J].Andrologia，2011，43（1）：48-51.

[17]張靜雯，伍捷陽，池霖生，等.睪丸不動精子行卵細胞漿內單精子注射的臨床效果分析[J].中國優生與遺傳雜志，2013，（7）：107-109.

[18]Ma S，Nigro MK，Rowe T，et al.Selection of viable sperm from frozen-thawed immotile spermatozoa based on the phenomenon of sperm tail curling in men who underwent testicular biopsy and epididymal sperm aspiration[J].Fertil Steril，2000，74（1）：172-173.

（收稿日期：2017-06-27 本文編輯：崔建中）endprint