男性年齡與精子頂體酶活性及精子DNA碎片指數的相關性分析

李雪瑤，楊菁，李潔，徐玲

(武漢大學人民醫院生殖醫學中心，武漢 430060)

男性年齡與精子頂體酶活性及精子DNA碎片指數的相關性分析

李雪瑤，楊菁*，李潔，徐玲

(武漢大學人民醫院生殖醫學中心，武漢 430060)

目的探討男性年齡與精子頂體酶活性、精子DNA碎片指數(DFI)的相關性。方法選取2016年1～8月在我院生殖醫學中心就診的436例不育癥男性患者為研究對象，所有患者均行精液常規檢查、精子頂體酶活性檢查和(或)精子DFI分析。將患者按年齡分為<30歲、30～39歲、≥40歲3組，分析各組的精液常規、頂體酶活性及精子核DFI的差異及其相關性。結果不同年齡段患者的體重指數(BMI)、禁欲天數、精液量無顯著性差異(P>0.05)；年齡≥40歲組患者的前向運動精子百分率、活動精子百分率及精子頂體酶活性顯著低于<30歲和30～39歲組(P<0.05)；≥40歲組患者的精子DFI顯著高于<30歲和30～39歲組(P<0.05)。年齡與前向運動精子百分率及活動精子百分率之間呈負相關(P<0.05)，但是相關性較弱。精子頂體酶活性與精子正常形態率、前向運動精子百分率、非前向運動精子百分率、活動精子百分率呈正相關(P<0.05)；精子DFI與年齡、禁欲天數、前向運動精子百分率呈正相關(P<0.01)，與精液量、精子濃度、活動精子百分率呈負相關(P<0.05)；精子頂體酶活性和DFI之間無相關性(P>0.05)。結論年齡增長會導致精液前向運動精子百分率、活動精子百分率、精子頂體酶活性、DFI等參數改變，直接或間接影響男性生育力。說明年齡對男性不育的影響是多方面的，建議有生育需求的大齡(≥40歲)男性盡早進行生育咨詢與評估。

男性； 年齡； 頂體酶活性； 精子DNA碎片指數； 精液常規

(JReprodMed2017，26(9)：869-873)

不孕不育不僅影響患者身心健康，而且嚴重影響家庭和諧，逐漸成為一個全球性的問題。與此同時，晚婚晚育、二胎政策的開放以及失獨等社會因素，使得大量高齡夫妻有了迫切的生育要求。但是，越來越多的證據表明，隨著年齡增大，女性的生育力明顯下降，且男性生育力也有所下降[1-3]。一般認為，女性年齡超過35歲，其生育力、正常受精率、妊娠率及活產率等明顯下降，而年齡對于男性生育力的影響以及影響程度，目前尚無定論。大數據的回顧性分析發現，在調整了其他因素的影響后，女性年齡≥35歲，流產風險明顯升高；而當女性年齡≥35歲，且男性年齡≥40歲時，其流產的風險值更高[4-5]。有研究表明，男性年齡的增大會導致男性性功能下降，以及精液質量如精子正常形態率與精子活力的下降[6-7]。精子頂體酶是一種以酶原形式貯存在精子頂體內的胰蛋白酶，受精時，精子頂體酶釋放，為精卵結合創造條件[8]，因此著床率的下降可能與頂體酶活性的降低、精卵結合困難有關。也有學者發現，男性年齡的增大使精子基因組的缺陷發生率增大[9]，比如與患病率顯著增加相關的基因組與精子外遺傳性缺陷，也可能與精子DNA碎片指數(DFI)增大[10]、氧化應激損害等有關。還有研究表明，在自然妊娠與人工授精過程中，去掉女性年齡因素的影響后發現，隨著其配偶的年齡增大，女性妊娠率降低，而自然流產率增高[11-12]。

本研究擬通過分析、比較不同年齡段的男性(<30歲、30～39歲、≥40歲)精液常規參數、精子頂體酶活性及精子DFI的關系，探討年齡對男性不育的影響。

材料與方法

一、研究對象

收集2016年1～8月在我院生殖醫學中心就診的不育癥男性患者資料。納入標準：(1)身體狀況良好；(2)體格檢查男性生殖器無發育畸形；(3)抽血排除肝腎功能異常等；(4)進行了精液常規檢查、精子頂體酶活性檢查和(或)精子DFI分析。排除標準：(1)精液不液化；(2)手淫取精失敗或精液灑出等。所有患者簽署知情同意書，一共納入436例患者，全部進行了精液常規的檢查，其中277例患者進行了精子頂體酶活性的檢查，415例患者進行了精子DFI檢查，257例患者同時進行了精子頂體酶活性與精子DFI檢查。

二、研究方法

1.分組：根據年齡不同將患者分為3組：<30歲組(96例)、30～39歲組(253例)、≥40歲組(87例)。

2.精液標本采集及處理：建議患者禁欲3～7 d，手淫取精法獲取精液，并將全部精液裝于一次性尿杯，37℃水浴箱內液化30 min。排除液化時間大于60 min的標本。

3.精液常規檢查：參照第五版《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》[13]推薦的方法檢測，包括精液體積、液化時間、pH值、精子濃度、正常形態率、精子活力。精液分析儀為西班牙CSA全自動精子質量分析系統。

4.精子頂體酶活性檢測：使用精子頂體染色試劑盒(PSA-FITC，深圳華康生物)檢測精子頂體酶活性，簡要步驟如下：測定精液常規參數后，測定和對照Ep管中加入7.5×106個精子，離心去除精漿，按照試劑盒使用說明操作，依次加入相關試劑，水浴后離心，紫外分光光度計讀取各管405 nm的OD值，計算頂體酶活性。精子頂體酶活性正常參考值為48.2～218.7 μIU/106精子。共檢查277例，<30歲組64例，30～39歲組157例，≥40歲組56例。

5.精子DFI檢查：采用精子核染色體結構檢測(SCSA法)，使用精子核碎片檢試劑盒(杭州星博生物科技)，調整精子密度為1×106～2×106個/ml，取100 μl檢測精子染色質結構完整性。嚴格按照試劑盒說明書操作步驟，使用流式細胞儀(Accuri C6，BD，美國)進行定量分析，通過軟件計算精子DFI。DFI正常參考值<15%，15～30%為偏高，≥30%認為碎片指數異常，考慮精子核DNA完整性差。共檢查415例，<30歲組90例，30～39歲組240例，≥40歲組85例。

三、統計學分析

結 果

一、各組患者一般資料及精液常規參數比較

各組患者的體重指數(BMI)均在正常范圍內，組間比較無顯著性差異(P>0.05)。精液常規參數比較發現：<30歲與30～39歲組的精子濃度略高于≥40歲組，但無顯著性差異(P>0.05)；前向運動精子百分率及活動精子百分率顯著高于≥40歲組(P<0.05)。30～39歲組的精子正常形態率顯著高于≥40歲組(P<0.05)。3組患者禁欲天數、精液量及非前向運動精子百分率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組患者的一般資料與精液常規參數比較(-±s)

注：與≥40歲組比較，*P<0.05，**P<0.01

二、患者年齡與BMI、精液常規參數的相關性

統計結果顯示：年齡與BMI、禁欲天數、精液量、濃度、正常形態率、非前向運動精子百分率之間無相關性，與前向運動精子百分率及活動精子百分率之間呈負相關(P<0.05)，但是相關性較弱(r分別為-0.079和-0.142)(表2)。

表2 患者年齡與BMI、精液常規參數的相關性

三、三組患者精子頂體酶活性與DFI的比較

統計結果表明：與≥40歲組相比，<30歲與30～39歲組的精子頂體酶活性顯著升高(表3a)，而DFI顯著下降(P均<0.05)(表3b)

表3a 不同年齡段男性精子頂體酶活性比較(-±s)

注：與≥40歲組比較，*P<0.05

表3b 不同年齡段男性精子DFI比較(-±s)

注：與≥40歲組比較，**P<0.01

四、頂體酶活性及DFI與年齡及精液常規參數的相關性

相關性分析結果顯示：精子頂體酶活性與精子正常形態率、前向運動精子百分率、非前向運動精子百分率、活動精子百分率呈正相關(P<0.05)；精子的DFI與年齡、禁欲天數、前向運動精子百分率呈正相關(P<0.01)，與精液量、精子濃度、活動精子百分率呈負相關(P<0.05)；精子頂體酶活性和DFI之間無相關性(表4)。

討 論

本文通過分析<30歲、30～39歲、≥40歲3個不同年齡段男性的精液常規檢查、精子頂體酶活性與精子DFI結果的相關性，探討年齡對男性不育的影響，結果顯示隨著年齡的增長，男性的BMI、禁欲天數、精液體積無明顯變化，精子濃度呈下降趨勢，特別是≥40歲的男性，但是差異無統計學意義。<30歲與30～39歲男性之間的精液參數、頂體酶活性與DFI無明顯差異，而≥40歲男性的精子正常形態率與前向運動精子百分率、活動精子百分率、頂體酶活性較<30歲與30～39歲男性相比明顯下降，DFI呈顯著上升趨勢(P均<0.05)，說明男性年齡對男性不育有多方面的影響，其進一步的關系需要更大樣本量的研究。

有研究表明，男性年齡的增大導致的不育與精液體積、精子數量的減少、精子活力的下降，以及正常形態精子的減少密切相關[14-15]，這與本研究結果一致。供卵試管嬰兒中，消除了女性年齡的影響后發現，男方年齡超過50歲后，囊胚形成率與妊娠結局受到明顯影響，而且隨著年齡的增大，精液體積與精子活性有下降趨勢[16]。精子頂體酶下降會導致卵丘分解及透明帶的穿透失敗，從而影響男性生育力[10]。精子核DNA 關系到父系遺傳，DNA的完整性是保持物種完整性、成功受精和胚胎發育的基礎。Aitken等[17]研究發現，隨著男性年齡的增加，精子DFI也隨之升高，二者呈明顯正相關，與本研究一致。多項研究表明，DFI能夠較準確地評價男性生育力，精子DNA損傷可以導致受精失敗或影響受精后原核的形成、胚胎著床、胚胎發育和子代的健康[18-19]。年齡的增大導致核苷酸的多態性，有研究顯示，隨著父方年齡的增大，單基因新創突變會每年增加兩個[20]，這可能對子代造成極大的影響。還有研究證實，年齡>35歲的男性，其總睪酮與游離睪酮顯著低于年齡≤35歲的男性，而LH與FSH無明顯差異[21]，說明年齡越大的男性，其睪丸對LH與FSH的反應性越差，從而間接影響男性生育力。而年齡的增大，可由于氧化應激[22]、內分泌問題[10]、輻射等多種原因，導致男性不育。有學者認為，年齡增長導致男性睪丸、附睪等生殖系統器官發生退化，性功能減退導致不育[23]。也有人認為，由于年齡的增大，罹患各種疾病的概率因此增大，間接影響男性生育力[24]。

進行相關性分析發現，精子正常形態率、前向運動精子百分率、非前向運動精子百分率以及活動精子百分率與精子頂體酶活性正相關(P<0.05)，說明精子頂體酶活性能夠較好地反映精液質量，提示其可以作為評估男性生育力的指標之一，這與之前一些文獻[25-29]的觀點一致。有學者認為，精子畸形可能導致頂體缺失、過薄、頂體不完整等情況[30-32]，可能影響卵細胞卵丘的分解及精子對卵母細胞透明帶的穿透[8]，從而導致男性不育。DFI與年齡、禁欲天數呈正相關，這與劉安娜[33]的研究一致，可能因為年齡與禁欲天數的增加，導致氧化應激等的累積增多，精子DNA的損傷加重，因此DFI增加。Evenson等[34]認為DFI 10%～15%為高生育力，16%～29%為中度生育力，≥30%為低度生育力，≥80%為無生育能力。本研究中，<30歲男性平均DFI為24.33%，30～39歲男性25.10%，≥40歲男性高達37.80%，3組患者DFI平均值均較高，可能因為本研究納入的人群較多傾向于不育患者。

綜上所述，男性不育的影響因素有多種，且機制錯綜復雜，年齡只是其中一個直接或間接的因素，但是年齡對于男性不育的影響是多方面的。雖然相對于女性，男性年齡對于妊娠結局的影響較小，但是年齡對于男性不育的影響仍是不可忽視的，所以對有生育需求的年齡較大的男性，特別是超過40歲的男性，建議盡早進行相關檢查，進行生育咨詢與評估。

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[編輯：辛玲]

Relationshipbetweenspermacrosinactivity&spermDNAfragmentationindexandmaleage

LI Xue-yao，YANG Jing*，LI Jie，XU Ling

ReproductiveMedicalCenter，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060

Objective： To analyze the relationship between male age and sperm acrosin activity，sperm DNA fragmentation index (DFI).

Methods： A total of 436 infertile men in our reproductive medical center from January to August 2016 were investigated.All the patients were conducted the examination of semen parameters，sperm acrosin activity and (or) sperm DFI.The patients were divided into 3 groups according to male age：<30 years group，31-39 years group，and≥40 years group.Comparison and correlation analysis among their semen parameters，sperm acrosin activity and sperm DFI were conducted.

Results： There were no significant differences in BMI，days of abstinence，semen volume among the three groups (P>0.05).The percentage of morphologically normal sperm，progressive sperm rate and sperm motility，sperm acrosin activity in ≥40 years group were significantly lower (P<0.05)，but DFI was significantly higher than <30 years group and 31-39 years group (P<0.05).There was a negative correlation between age and progressive sperm rate and sperm motility (P<0.05).There were positive correlations between sperm acrosin activity and the percentage of morphologically normal sperm，progressive sperm rate and motility (P<0.05).Sperm DFI was positively correlated with age，abstinence days，progressive sperm rate (P<0.01)，while it was negatively correlated with semen volume，semen concentration & motility (P<0.05).No correlation was found between sperm acrosin activity and DFI.

Conclusions： Increase of male age can lead to the deterioration of progressive sperm rate，sperm motility，sperm acrosin activity and sperm DFI，and directly or indirectly affects male infertility.Preconception counseling and evaluation of fertility are recommended for elder men (≥40 years) with reproduction requirement.

Male； Age； Sperm acrosin activity； Sperm DNA fragmentation index； Semen parameters

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.09.004

2017-03-21；

2017-04-24

國家自然科學基金(81401255)

李雪瑤，女，湖北咸寧人，碩士研究生，生殖醫學專業.(*

，Email：dryangqing@hotmail.com)