養肝解毒散結中藥對肝癌血管生成作用及機制*

胡 兵安紅梅王雙雙鄭佳露閆 霞黃曉偉

1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院腫瘤科（上海，200032） 2.上海市中醫藥研究院中醫腫瘤研究所 3.上海中醫藥大學附屬龍華醫院科技處

養肝解毒散結中藥對肝癌血管生成作用及機制*

胡 兵1，2安紅梅3王雙雙1，2鄭佳露1，2閆 霞1，2黃曉偉1，2

1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院腫瘤科（上海，200032） 2.上海市中醫藥研究院中醫腫瘤研究所 3.上海中醫藥大學附屬龍華醫院科技處

目的：觀察養肝解毒散結（YGJDSJ）中藥對肝癌血管生成的作用。方法：裸小鼠皮下移植人肝癌Bel-7402細胞，隨機分為兩組，每組10只，分別給予蒸餾水或YGJDSJ灌胃，1次/d，治療3周后，剝離腫瘤組織，免疫組織化學法檢測血管生成及相關基因表達。結果：YGJDSJ中藥可以抑制Bel-7402人肝癌組織血管生成，與對照組比較差異有顯著性意義（P＜0.01）；YGJDSJ中藥可降低肝癌組織血管內皮生長因子（VEGF）和乏氧誘導因子-1α（HIF-1α）表達，與對照組比較差異有顯著性意義（P＜0.01）；YGJDSJ中藥還可降低M2型腫瘤相關巨噬細胞在肝癌組織的分布，與對照組比較差異有顯著性意義（P＜0.01）。結論：YGJDSJ中藥可以抑制肝癌血管生成，其機制與下調VEGF、HIF-1α和M2型腫瘤相關巨噬細胞相關。

肝癌；養肝解毒散結中藥；血管生成；血管內皮生長因子；乏氧誘導因子-1a；M2型腫瘤相關巨噬細胞

中醫藥是我國重要的生物醫藥資源，在肝癌的治療中發揮了積極的作用［1］。養肝解毒散結中藥復方（專利號：ZL201110145109.0）是項目組治療肝癌臨床驗方，由女貞子、炙鱉甲、龍葵、蛇莓、澤漆、貓爪草、郁金、虎杖等中藥組成；其中女貞子所含熊果酸可以抑制肝癌VEGF表達和血管生成［2］，龍葵、蛇莓、郁金可以抑制雞胚尿囊膜血管生成［3～5］，虎杖單體白藜蘆醇和大黃素可以抑制腫瘤血管生成［6，7］，提示養肝解毒散結中藥復方可能具有抑制血管生成的作用。本實驗研究擬觀察養肝解毒散結中藥對肝癌血管生成的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞株 BALB/C裸小鼠20只，6周齡，雌性，體重18～23g，購自上海斯萊克實驗動物公司，實驗動物許可證：SCXK（滬）2012－0002，飼養于龍華醫院SPF級動物實驗室。人肝癌Bel-7402細胞購自中國科學院細胞庫。

1.2 主要儀器及試劑 培養箱，美國NuAire公司產品；低溫離心機，美國Thermo公司產品；倒置顯微鏡，日本NIKON公司產品。DMEM、胎牛血清購自Hyclone公司。中藥由龍華醫院中藥房提供并鑒定。CD31、血管內皮生長因子（VEGF）、乏氧誘導因子-1α（HIF-1α）、精氨酸酶/（Arg-1）抗體購自Santa Cruz生物技術公司。其余為國產分析純試劑。

1.3 中藥制備 養肝解毒散結（YGJDSJ）中藥由女貞子12 g，炙鱉甲30g，龍葵、蛇莓、澤漆、貓爪草、郁金、虎杖各15g等組成，按比例配方，加8倍量的水，浸漬1 h；炙鱉甲武火煮沸后文火煎煮0.5 h，加入其他中藥煮沸后文火煎煮0.5 h，濾過；濾渣再加6倍量的水煎煮0.5 h，濾過；合并濾液，濃縮至2 g/ml，4℃儲存備用。

圖1 中藥對肝癌血管生成影響圖(HE,×200)

圖3 中藥對肝癌組織HIF-1α表達影響圖(HE,×200)

圖2 中藥對肝癌組織VEGF表達影響圖(HE,×200)

圖4 中藥對肝癌組織相關巨噬細胞影響圖(HE,×200)

1.4 動物模型制備及分組 常規培養Bel-7402細胞，消化并計數，用PBS調整細胞濃度至5×107個/ml，每只裸小鼠給予無菌皮下注射0.1 m l細胞懸液；待腫瘤生長至可測量范圍后隨機分為對照組和YGJDSJ組，分別給予蒸餾水和YGJDSJ中藥灌胃，0.3 ml/次，1次/d；兩組動物均給予飼料，自由飲用無菌水。治療3周后處死小鼠，保留腫瘤標本備用。

1.5 免疫組織化學檢測 腫瘤組織常規固定、石蠟包埋、切片、脫蠟，3%H2O2封閉10min，PBS沖洗；檸檬酸緩沖液中（pH6.0）煮沸修復抗原，PBS洗滌；3%H2O2抑制內源性過氧化物酶，PBS洗滌；正常動物血清孵育5min，PBS洗滌；加入CD31、VEGF、HIF-1α、Arg-I（濃度1∶100）4℃過夜，PBS沖洗；加入對應二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，常規封片；Image Pro軟件分析蛋白表達平均光密度值（MOD），結果以對照組倍數表示。

1.6 統計學方法 使用SPSS 18.0進行統計，計量資料以±s表示，兩組之間比較采用t檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠肝癌組織血管生成性況 采用CD31作為新生血管標志，免疫組化檢測新生血管生成情況，結果顯示對照組小鼠肝癌組織有較多新生血管生成，YGJDSJ中藥可以抑制肝癌血管生成，與對照組比較差異顯著（P＜0.01）。見表1及插頁圖。

表1 兩組小鼠肝癌組織血管生成平均光密度比較（±s）

表1 兩組小鼠肝癌組織血管生成平均光密度比較（±s）

與對照組比較，**P＜0.01

組別 n血管生成（MOD）1.00±0.07 YGJDSJ組 3 0.43±0.04對照組3 **

2.2 兩組小鼠肝癌組織VECF表達情況 免疫組化檢測結果顯示，對照組小鼠肝癌組織VEGF表達明顯，YGJDSJ中藥可以抑制肝癌組織VEGF表達，與對照組比較差異顯著（P＜0.01）。見表2及插頁圖1。

表2 兩組小鼠肝癌組織VEGF表達平均光密度值比較（±s）

表2 兩組小鼠肝癌組織VEGF表達平均光密度值比較（±s）

與對照組比較，**P＜0.01

組別 n VEGF（MOD）1.00±0.06 YGJDSJ組 3 0.34±0.03對照組3 **

2.3 兩組小鼠組肝癌組織HIF-1α表達情況 免疫組化檢測結果顯示對照組小鼠肝癌組織有較多HIF-1α表達，YGJDSJ中藥可以抑制肝癌組織HIF-1α表達，與對照組比較差異顯著（P＜0.01）。見表3及插頁圖3。

表3 兩組小鼠肝癌組織HIF-1α表達平均光密度值比較（±s）

表3 兩組小鼠肝癌組織HIF-1α表達平均光密度值比較（±s）

與對照組比較，**P＜0.01

組別 n HIF-1α（MOD）對照組3 ** 1.00±0.05 YGJDSJ組 3 0.25±0.03

2.4 兩組小鼠肝癌組織腫瘤相關巨噬細胞分布情況 采用Arg-I作為M2型腫瘤相關巨噬細胞（TAMS）標志，免疫組化檢測M2TAMS在肝癌組織的分布，結果顯示對照組肝癌小鼠組織有較多M2TAMS分布，YGJDSJ中藥治療后肝癌組織M2TAMS分布顯著減少，與對照組比較差異顯著（P＜0.01）。見插頁圖4，表4。

表4 兩組小鼠肝癌組織腫瘤相關巨噬細胞分布平均光密度值比較（±s）

表4 兩組小鼠肝癌組織腫瘤相關巨噬細胞分布平均光密度值比較（±s）

與對照組比較，**P＜0.01

組別 n TAM（MOD）1.00±0.04 YGJDSJ組 3 0.31±0.03對照組3 **

3 討論

根據臨床表現，肝癌可以歸屬于中醫“鼓脹”、“黃疸”、“積聚”、“脅痛”、“肝積”、“肥氣”、“伏梁”等范疇。歷代醫家對相關病證有一定闡發，如《靈樞·邪氣臟腑病形篇》記載“肝脈微急為肥氣，在脅下，若覆杯”，“伏梁，在心下”。《難經·五十五難·五臟攸分》記載＂肝之積名曰肥氣，在左脅下如覆杯＂，《濟生方·癓瘕積聚門》描述“肥氣之狀，在左脅下，覆大如杯，肥大而似有頭足，是為肝積”。

肝癌臨床表現復雜，涉及多個病理因素，屬正虛邪實之證，正虛是肝癌發病的內因；現代中醫發展了癌毒的概念，癌毒是肝癌發生發展的病理基礎，抗癌是治療肝癌的重要法則，可以認為虛、毒、瘀是肝癌的基本病機［1，8］。養肝解毒散結方由多味中藥組成，其中女貞子、炙鱉甲滋陰養肝、散結；龍葵、蛇莓解毒散結；澤漆、貓爪草化痰散結；郁金、虎杖化瘀散結；諸藥合用，共奏養肝解毒散結之功。

腫瘤組織由于生長失控、血管紊亂，腫瘤內部氧水平降低，促使腫瘤細胞通過無氧酵解、腫瘤血管生成等方式以適應乏氧環境；在乏氧條件下HIF-1α蛋白水平升高，HIF-1α可直接結合VEGF啟動子，上調VEGF表達，促腫瘤血管生成［9］。本研究結果顯示，養肝解毒散結中藥可以抑制肝癌組織血管生成，同時伴隨VEGF和HIF-1α表達降低，提示養肝解毒散結中藥對肝癌血管生成抑制作用與下調VEGF和HIF-1α表達相關。

M2型TAMS是介導腫瘤炎癥（Cancer-related inflammation）的主要細胞群體，低表達IL-12、IL-23，高表達IL-10和Arg-I，Arg-1是M2 TAMS的標志基因［10］。腫瘤細胞可以分泌IL-10、CSF-1等細胞因子，促使單核細胞分化為M2 TAMS。此外，腫瘤組織因乏氧高表達的HIF-1α也可以上調CXCL8和CXCR4促M2 TAMS分化。M2 TAMS可以抑制抗腫瘤免疫，促腫瘤轉移，也可以通過分泌VEGF促腫瘤血管生成。本研究結果顯示，養肝解毒散結中藥治療后肝癌組織M2 TAMS分布減少。

綜上所述，本研究結果顯示：養肝解毒散結中藥可以抑制肝癌血管生成，其機制與下調VEGF、HIF-1α和M2型腫瘤相關巨噬細胞相關，值得進一步深入研究。

［1]Hu B，Wang SS，Du Q.Traditional Chinese medicine for prevention and treatmentof hepatocarcinoma：From bench to bedside［J］.World J Hepatol，2015，7（9）：1209-1232.

［2]高福君.女貞子提取物抑制人肝癌細胞血管生長因子表達作用研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（2）：139-142.

［3]許揚，潘瑞樂，常琪，等.龍葵抑制雞胚絨毛尿囊膜血管新生的研究［J］.中國中藥雜志，2008，33（5）：549-552.

［4]許揚，潘瑞樂，常琪，等.蛇莓抑制雞胚絨毛尿囊膜血管新生作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2008，24（3）：65-67.

［5]肖淵，李娜，李海芳，等.觀察12種活血祛瘀類中藥對雞胚絨毛尿囊膜新生血管生成的影響［J］.藥物分析雜志，2009，29（7）：1079-1082.

［6]Kimura Y，Okuda H.Resveratrol isolated from Polygonum cuspidatum root prevents tumor growth and metastasis to lung and tumor-induced neovascularization in Lewis lung carcinoma-bearingmice［J］.JNutr，2001，131（6）：1844-1849.

［7]Lin SZ，WeiWT，Chen H，et al.Antitumor activity of emodin against pancreatic cancer depends on its dual role：promotion of apoptosis and suppression of angiogenesis［J］.Plos One，2012，7（8）：e42146.

［8]杜琴，胡兵，沈克平.肝癌中醫病機與治法研究［J］.世界中西醫結合雜志，2010，5（9）：814-817.

［9]Masoud GN，LiW.HIF-1αpathway：role，regulation and intervention for cancer therapy［J］.Acta Pharm Sin B，2015，5（5）：378-389.

［10]Deng S，Hu Bing，Shen KP，et al.Inflammation，macrophage in cancer progression and Chinese herbal treatment［J］.JBasic Clin Pharm，2012，2（3）：269-272.

Effects and M echanism of YangGan JieDu SanJie Herbs on Angiogenesis in Hepatocellular Carcinoma*

HU Bing1，2AN Hong-Mei3，WANGShuang－Shuang1，2，etal.1.Departmentof Oncology，Longhua Hospital，ShanghaiUniversity of Traditional Chinese Medicine（Shanghai，200032）China

Objective：To observe the effects of YangGan JieDu SanJie herbs（YGJDSJ）on angiogenesis in human hepatocellular carcinoma.Methods：Nudemice subcutaneously transplanted with Bel－7402 human hepatocarcinoma cellswere random ly divided into two groups（10mice per group），and intragastric administered with distilled water or YGJDSJdaily.After threeweeks of treatment，the tumorswere dissected.Gene expression was detected by IHC（Immunohistochemistry）.Results：compared with control group，YGJDSJ could significantly inhibitangiogenesis and down－regulated VEGF（Vascular endothelialgrowth factor）and HIF-1α（Hypoxia Inducible Factor-1α）expression in Bel-7402 hepatocarcinoma（P＜0.01）.At the same time，YGJDSJalso could significantly decrease distribution of TAMs（Tumor－associated macrophages）in Bel－7402 hepatocarcinoma（P＜0.01）.Conclusion：YGJDSJ can inhibit angiogenesis in hepatocarcinoma and may relate to down-egulation of VEGF，HIF-1αand TAMs.

Hepatocellular carcinoma；angiogenesis；YangGan JieDu SangJie；VEGF；HIF－1α；Tumor－associated macrophages

2016－10－26 編輯：程良斌）

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.03.012

國家自然科學基金（No.81473625）；上海市中醫藥事業發展三年行動計劃（No.ZY3-CCCX-3-3025）；上海市科技支撐項目（No.16401902500）