川芎嗪調控PKCβ1減輕波動高糖誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的實驗研究

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·基礎醫學論著/研究·

川芎嗪調控PKCβ1減輕波動高糖誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的實驗研究

王景尚1，黃燁2，殷惠軍3，孫明月2，石穎2

目的觀察川芎嗪對波動高糖誘導人臍靜脈內皮細胞損傷及蛋白激酶Cβ1(PKCβ1)表達的影響。方法分離、鑒定并培養人臍靜脈內皮細胞，實驗共分為7組：正常低糖(N)組、穩定高糖(W)組、波動高糖(B)組、穩定高糖+LY333531(WL)組、波動高糖+LY333531(BL)組、波動高糖+川芎嗪(TMP)組和波動高糖+二甲雙胍(MH)組。8 d后檢測各組細胞凋亡率、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、可溶性細胞間黏附分子1(sICAM-1)、晚期氧化蛋白產物(AOPP)和總抗氧化能力(T-AOC)水平及細胞PKCβ1蛋白表達情況。結果與N組相比，W組和B組HUVECs總凋亡率、TNF-α、sICAM-1、AOPP含量、PKCβ1蛋白表達均顯著升高(P<0.01)，T-AOC顯著降低(P<0.01)，且W組和B組間差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。應用TMP和MH干預具有與LY333531阻斷相似的效應，可顯著降低細胞的總凋亡率、TNF-α、sICAM-1、AOPP含量及PKCβ1蛋白表達(P<0.01)，同時可顯著升高T-AOC水平(P<0.01)。結論波動性高糖狀態具有顯著加重人臍靜脈內皮細胞損傷的效應，且該效應與PKCβ1表達水平顯著升高密切相關；川芎嗪對波動性高血糖狀態下的血管內皮功能具有明顯的保護作用，其作用機制與其顯著抑制PKCβ1的過表達進而減輕氧化應激和炎癥反應密切相關。

臍靜脈內皮細胞損傷；川芎嗪；波動高糖；蛋白激酶Cβ1；腫瘤壞死因子α；可溶性細胞間黏附分子1

2型糖尿病是冠心病的等危癥，血管并發癥的發生是糖尿病病人出現高致殘率、高致死率的主要原因[1]。課題組前期通過納入冠心病病人并應用寡核苷酸基因芯片技術成功構建了冠心病白細胞差異基因表達譜，同時深入分析發現，其中的差異基因蛋白激酶Cβ1(PKCβ1)位于冠心病疾病網絡的關鍵調控環節[2]。高血糖狀態是糖尿病病人的顯著特征，與血管損傷在內的糖尿病長期并發癥的發生發展密切相關。大量臨床和基礎研究證實，相對于血糖控制良好的穩定性高血糖病人，血糖控制不良的“波動性高血糖”糖尿病病人更易出現慢性血管并發癥，而且血糖波動的幅度越大，其并發癥的發生率就越高、預后就越差[3-5]。這已成為目前糖尿病預防和治療研究領域的熱點之一。蛋白激酶C(PKC)途徑被認為是糖尿病血管病變的關鍵機制[6]。基于此，推測冠心病關鍵調控基因蛋白激酶Cβ1參與波動性高血糖誘導的血管內皮損傷過程。現代藥理研究發現，川芎嗪具有較好的抗脂質過氧化和保護血管內皮細胞功能等作用[7-8]，那么，其保護血管內皮功能的作用是否與調控PKCβ1基因有關？其在波動性高血糖血管病變中是否也發揮重要作用呢？基于此，本研究通過體外構建波動性高血糖誘導損傷人臍靜脈內皮細胞實驗模型，探討川芎嗪對波動高糖損傷血管內皮的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 鹽酸川芎嗪(Tetramethylpyrazine hydrochloride，TMP，批號：201121126)、鹽酸二甲雙胍原料藥(metformin hydrochloride，MH，批號：20111125)均購自大連美侖生物技術有限公司；LY333531(PKCβ1抑制劑，批號：02011306)購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 人臍靜脈內皮細胞的分離、培養與鑒定 健康產婦臍帶取自北京海淀區婦幼保健醫院。人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的分離方法參照Jaffe等[9]方法。無菌條件下取健康產婦正常分娩的新生兒臍帶應用0.1%膠原酶Ⅰ臍靜脈灌流消化分離細胞15 min，以1 500 r/min離心10 min，收集內皮細胞。接種于含20%胎牛血清、10 ng/mL EGF、40 U/mL肝素、20 mmol/L谷氨酰胺、50 U/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素、0.11 mg/mL丙酮酸鈉的低糖型DMEM培養基中，再置于含5% CO2的37 ℃培養箱中培養24 h換液，以后每2 d～3 d更換一次，觀察細胞生長情況，倒置相差顯微鏡下觀察到內皮細胞形態單一，呈棱形或多角形，細胞邊界清楚，胞質豐富，胞核呈橢圓形、靠近中央，核仁明顯。檢查3 d～5 d細胞融合連成片，鋪滿培養瓶，呈鵝卵石樣排列，以0.25%胰酶-EDTA溶液消化傳代培養。所用實驗細胞均為第3代～5代細胞。

1.3 實驗分組及干預 實驗分為7組。正常低糖(N)組：持續低糖型DMEM全培養基培養；穩定性高糖(W)組：持續高糖型DMEM全培養基培養；波動性高糖(B)組：高糖型DMEM全培養基/低糖型DMEM全培養基培養，每24 h更換一次；穩定性高糖+LY333531(WL)組：對穩定性高糖組進行LY333531(200 nmol/L)干預，預處理1 h；波動性高糖+LY333531(BL)組：對波動性高糖組進行LY333531(200 nmol/L)干預，預處理1 h；鹽酸川芎嗪(TMP)組：對波動性高糖組運用川芎嗪(500 μmol/L)進行干預和鹽酸二甲雙胍(MH)組：對波動性高糖組運用鹽酸二甲雙胍(1 mmol/L)進行干預。各組細胞在37 ℃，5% CO2條件下培養8 d后，收集細胞上清液進行進一步檢測。

1.4 指標檢測 采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡水平，定量ELISA法測定細胞上清液腫瘤壞死因子α(TNF-α)、可溶性細胞間黏附分子1(sICAM-1)、晚期氧化蛋白產物(AOPP)和總抗氧化能力(T-AOC)水平，Western blot法檢測細胞PKCβ1蛋白表達。

2 結 果

2.1 不同培養條件葡萄糖培養及藥物干預對HUVECs凋亡的影響 與N組相比，W組和B組HUVECs總凋亡率均明顯增加(P<0.01)，且凋亡以晚期凋亡為主，組間差異有統計學意義(P<0.05)；應用LY333531阻斷后，WL組和BL組細胞總凋亡率均顯著下降(P<0.05或P<0.01)；應用TMP和MH干預亦可顯著降低細胞的總凋亡率(P<0.01)，二者均以抑制早期凋亡為主。詳見圖1、圖2。

注：與N組相比，*P<0.05，**P<0.01；與W組相比，#P<0.05，##P<0.01；與B組相比，▲P<0.01。圖1 不同培養條件葡萄糖培養及藥物干預對HUVECs凋亡的影響

圖2 不同培養條件葡萄糖培養及藥物干預對細胞凋亡影響的典型流式圖

2.2 不同培養條件葡萄糖培養及藥物干預對HUVECs炎癥反應的影響 與N組相比，W組和B組HUVECs 炎癥因子TNF-α和sICAM-1含量均明顯增加(P< 0.01)；與W組相比，B組HUVECs TNF-α和sICAM-1含量又有進一步升高(P<0.05或P<0.01)；應用LY333531阻斷后，WL組和BL組細胞TNF-α和sICAM-1水平顯著下降(P<0.05或P<0.01)；應用TMP和MH干預后，細胞TNF-α和sICAM-1水平亦顯著下降(P<0.01)。詳見表1。

組別nTNF-αsICAM-1N組60.11±0.01 1.29±0.79W組60.14±0.021)4.23±1.061)B組60.17±0.021)3)5.85±2.291)2)WL組60.11±0.012)2.50±0.862)BL組60.12±0.024)3.26±1.414)TMP組60.13±0.034)3.44±1.174)MH組60.12±0.024)2.82±1.194) 與N組相比,1)P<0.01;與W組相比,2)P<0.05,3)P<0.01;與B組相比,4)P<0.01。

2.3 不同培養條件葡萄糖培養及藥物干預對HUVECs 氧化應激反應的影響 與N組相比，W組和B組HUVECs AOPP含量顯著增多(P<0.01)，T-AOC顯著降低(P<0.01)，且B組與W組比較差異有統計學意義(P<0.01)；應用LY333531阻斷后，WL組和BL組細胞AOPP含量均顯著下降(P<0.01)，同時伴T-AOC顯著升高(P<0.05或P<0.01)；應用TMP和MH干預后，AOPP含量均顯著下降(P<0.01)，且T-AOC顯著升高(P<0.01)。詳見表2。

組別nAOPP(pmol/L) T-AOC(U/L)N組6210.48±107.622652.08±253.94W組6527.45±202.891)2072.83±202.351)B組6677.05±123.361)2)1643.15±104.811)3)WL組6337.88±135.283)2358.78±209.172)BL組6402.77±102.854)2089.70±150.494)TMP組6368.01±75.714)2322.43±334.454)MH組6358.79±92.584)2089.27±205.224) 與N組相比,1)P<0.01;與W組相比,2)P<0.05,3)P<0.01;與B組相比,4)P<0.01。

2.4 不同培養條件葡萄糖培養及藥物干預對HUVECs PKCβ1蛋白表達的影響 與N組相比，W組和B組細胞PKCβ1蛋白表達均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，且B組與W組比較差異有統計學意義(P<0.05)；應用LY333531阻斷后，WL組和BL組PKCβ1蛋白表達水平顯著下降(P<0.01)；應用TMP和MH干預后，PKCβ1蛋白表達不同程度下降(P<0.05或P<0.01)，且作用與LY333531相似。詳見圖3。

注：與N組相比，*P<0.05，**P<0.01；與W組相比，

#P<0.05，##P<0.01；與B組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

圖3各組細胞PKCβ1蛋白表達水平的比較

3 討 論

川芎嗪是從傘形科藁本屬植物川芎中提取的生物堿—四甲基吡嗪，是川芎的有效成分之一。現代藥理學研究表明：川芎嗪具有保護血管內皮、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化應激等多種心腦血管藥理學作用，廣泛應用于閉塞性心腦血管疾病、糖尿病、腫瘤等多種疾病的治療[7，10]。血管內皮功能損傷是糖尿病血管病變發生發展的前提和基礎[11-12]。血糖波動被認為是糖尿病血管病變的重要危險因素之一，與血管并發癥的發生密切相關。

本研究應用流式細胞術測定細胞凋亡方法評價血糖波動對內皮細胞損傷的影響，結果表明，高糖狀態下內皮細胞凋亡率顯著上升，而且在波動高糖狀態下表現得更為明顯。提示，血糖波動性的增加具有加重內皮細胞損傷的效應。同時，應用LY333531阻斷PKCβ1表達以及川芎嗪和二甲雙胍干預，發現細胞凋亡率均顯著下降。提示，PKCβ1在波動高糖損傷內皮過程中具有重要作用，而藥物干預具有顯著拮抗波動高糖內皮損傷的作用，且與PKCβ1抑制劑的作用相似。

炎癥因子和黏附分子的分泌和釋放在糖尿病血管病變中具有重要作用[13]。TNF-α主要由單核/巨噬細胞分泌，是一種具有多種生物學效應的細胞因子。作為前炎癥因子，參與包括糖尿病在內的多種疾病的發生和病情演變，并直接參與血管病變的病理過程[14]。ICAM-1(CD54)是細胞間黏附分子的一種，屬于免疫球蛋白超家族，在炎癥細胞黏附、聚集中發揮重要作用。正常情況下，sICAM-1在內皮細胞處于低表達水平，但在白細胞介素-1(IL-1)、TNF-α和LPS等炎癥介質刺激后表達急劇增加，參與白細胞與血管內皮細胞黏附及向血管外遷移、黏附心肌細胞和釋放細胞毒的過程。氧化應激是導致糖尿病內皮損傷的重要原因[15-16]。晚期氧化蛋白產物是氧化應激過程中生成的一類含雙酪氨酸的蛋白交聯物，既能反映機體內氧化應激狀態，還可起到炎癥遞質的作用[17]。總抗氧化能力是機體酶性和非酶性抗氧化物整體水平的具體體現，能反映機體抗氧化酶的活力以及抗氧化系統所處的功能狀態[18]。本研究結果顯示：高糖刺激能顯著促使內皮細胞TNF-α、sICAM-1的合成增多，并顯著誘導內皮細胞過氧化產物的生成及抗氧化能力的下降，而波動高糖效應更加明顯。應用PKCβ1抑制劑干預可顯著逆轉血糖波動造成的損傷。應用川芎嗪和二甲雙胍干預均具有顯著抗炎、抑制細胞黏附、拮抗氧化的效應，且與PKCβ1抑制劑的作用相似。

既往研究表明，PKC在糖尿病病人中處于持續的活化狀態，同時參與糖尿病及其并發癥的發生與發展[19]。Quagliaro等[20]應用間斷性高血糖(5 mmol/L和20 mmol/L)培養基培養人臍靜脈內皮細胞2 周后發現PKC活化具有加重波動高糖損傷內皮的作用，而其亞型PKCβ1在該過程中發揮至關重要的作用。本研究中，測定內皮細胞中PKCβ1蛋白表達情況，并運用LY333531對其進行了阻斷，發現了相似的結果。應用川芎嗪和二甲雙胍干預均可顯著抑制PKCβ1蛋白表達。提示川芎嗪拮抗波動高糖內皮損傷效應與其顯著抑制內皮細胞PKCβ1過表達有關。

綜合本研究可以看出，波動性高血糖加重人臍靜脈內皮細胞損傷的作用與其能夠誘發PKCβ1過度表達密切相關；川芎嗪對波動性高血糖狀態下的血管內皮功能具有顯著保護效應，其機制與其抑制PKCβ1的過表達進而減輕氧化應激和炎癥反應密切相關。此外，本研究結果也提示川芎嗪在防治糖尿病血管并發癥中具有一定的應用前景，但仍有待進一步臨床研究驗證。

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(本文編輯郭懷印)

Tetramethylpyrazine Ameliorates High Blood Glucose Fluctuations Induced-human Umbilical Vein Endothelial Cell Injury by Regulating PKCβ1Expression

Wang Jingshang，Huang Ye，Yin Huijun，Sun Mingyue，Shi Ying

Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital，Capital Medical University，Beijing 100026，China Corresponding Author：Huang Ye (Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，China)

ObjectiveTo investigate the effects of Tetramethylpyrazine (TMP) on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injury induced by high blood glucose fluctuations and the PKCβ1expression.MethodsHUVECs were incubated for 8 days in media containing different glucose concentrations：5.56 mmol/L (normal glucose，N)，25 mmol/L (constant high glucose，W)，or a daily alternating 5.56 or 25 mmol/L glucose (fluctuant high glucose，B).LY333531 (200 nmol/L) was pretreated on W group (WL) and B group (BL)，respectively.Meanwhile，B group were treated with tetramethylpyrazine hydrochloride (500 μmol/L) and metformin hydrochloride (1 mmol/L)，respectively，which were called as TMP group and MH group.Cell apoptosis was measured by flow cytometry.The concentrations of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)，soluble intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1)，AOPP and total antioxidant capacity (T-AOC) in the cell culture supernatant were measured by ELISA method.The expression of protein kinase C (PKC) β1in HUVECs was measured by Western blot.ResultsIn comparison with N group，cell apoptosis rate (mainly late apoptosis)，levels of TNF-α，sICAM-1 and AOPP，the expression of PKCβ1in W group and B group were all significantly increased (P<0.05 or P<0.01)，whereas T-AOC was significantly decreased (P<0.01)，all especially in B group (P<0.05 or P<0.01).Pretreated with LY333531，cell apoptosis rate，levels of TNF-α，sICAM-1 and AOPP，as well as the expression of PKCβ1，were all significantly decreased (P<0.05 or P<0.01)，meanwhile T-AOC was significantly increased (P<0.05 or P<0.01).TMP and MH manifested the similar protective effects as LY333531.ConclusionHigh blood glucose can induce HUVEC injury obviously，which is closely related to PKCβ1over-expression.Tetramethylpyrazine can protect HUVECs suffering fluctuant high glucose obviously，and the protective mechanism of which is closely related to its effects of relieving vessel stress，alleviating inflammatory reaction and inhibitory effect on the expression of PKCβ1.

human umbilical vein endothelial cells injury；tetramethylpyrazine；high blood glucose fluctuations；protein kinase Cβ1；tumor necrosis factor-alpha；soluble intercellular adhesion molecule-1

國家自然科學基金青年基金資助項目(No.81202777)；國家自然科學基金面上項目(No.81573803)

1.首都醫科大學附屬北京婦產醫院(北京 100026)；2.中國中醫科學院西苑醫院；3.甘肅中醫藥大學

黃燁，E-mail：yellow_926@126.com

信息：王景尚，黃燁，殷惠軍，等.川芎嗪調控PKCβ1減輕波動高糖誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的實驗研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(16)：1969-1973.

R587 R285.5

：Adoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2017.16.006

：1672-1349(2017)16-1969-05

2017-01-26)