三七愈傷組織對滇重樓種子萌發的影響

石燕碧，武文君，梁暉輝，喬玉琪，武文奇，牛顏冰

（山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801）

三七愈傷組織對滇重樓種子萌發的影響

石燕碧，武文君，梁暉輝，喬玉琪，武文奇，牛顏冰

（山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801）

滇重樓為延齡草科重樓屬多年生草本植物，具有抗癌、止血等功效，市場應用前景廣闊，但其種子在實際生產中存在萌發周期長和萌發率低等缺點。為了縮短滇重樓種子萌發時間，提高其萌發率，在三七愈傷組織上對滇重樓種子進行暗培養和光照培養試驗。結果表明，在三七愈傷組織上進行暗培養能明顯縮短滇重樓種子的萌發時間，最快在第10天就開始萌發，萌發高峰期在第20～30天，平均萌發率為12.5%。

滇重樓；三七愈傷組織；種子萌發

滇重樓（Paris ployphylla Smith var.yunnanensis）又名云南滇重樓，以根莖入藥[1]，是云南白藥的主要原料，也是宮血寧、奪命丹、總皂苷片、季德勝蛇藥片、熱毒清等65個重要中成藥的主要組方原料[2]，具有抗癌、止血、鎮痛、鎮靜等功效[3]。然而，滇重樓種子有“2次休眠”的生理特征，在自然狀態下其發芽率很低，且不整齊[4]，需要經過2次發育[5]，即需經過2冬1夏才能萌發，生產周期比較長，遠不能滿足快速增長的市場需求。同時，經多年來的亂采濫挖，滇重樓野生資源已日趨枯竭，依靠野生滇重樓已遠遠不能滿足醫藥行業的需要，急需向人工栽培模式發展，但如何縮短滇重樓種子的萌發時間、提高萌發率是滇重樓人工繁育過程中亟待解決的難題。

本試驗采用培養皿進行看護培養的方式，研究三七愈傷組織對滇重樓種子萌發的影響，以期為滇重樓種子快速繁育和人工栽培提供一定的科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

三七愈傷組織，在山西農業大學生命科學學院組織培養實驗室進行培養，生長約15 d即可使用；滇重樓種子，購于河北安國中藥材市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子前處理 將滇重樓種子放在溫水里浸泡12 h后反復搓洗去掉紅皮，棄去上浮的種子，撈取沉在下面的種子，曬干冷藏于冰箱中，備用。

1.2.2 培養基的配制 按照配方MS＋0.5 mg/L NAA＋0.5 mg/L 6-BA＋3%蔗糖＋0.8%瓊脂粉，進行三七愈傷組織誘導培養基配制，pH值為5.6～5.8，經高壓蒸汽滅菌后，倒于培養皿待用。

1.2.3 種子消毒處理 試驗種子先經75%乙醇浸泡1 min后，用超純水沖洗2～3次，接著用20%的次氯酸鈉浸泡15 min，再用超純水沖洗5～6次，最后取出放于無菌濾紙上吸干種皮表面的水分，待接種。

1.2.4 接種處理 在超凈臺內挑取小塊三七愈傷組織（讓其在培養基上有個生長的空間）于培養基上，每個培養皿中均勻放置5小塊，然后在每塊三七愈傷組織上放大小約1 cm2且經過高壓滅菌的濾紙，然后在每片濾紙上接種2～4粒種子，封口。暗培養編號為1～6，光照培養編號為Ⅰ～Ⅵ，同時以無三七愈傷組織培養（種子直接接種在培養基上）為空白對照組。所有試驗種子放在溫度為（19± 2）℃的培養架上，分別進行暗培養和光照培養。

1.2.5 生根培養 為了進一步觀察滇重樓生根、生長情況，將培養皿中萌發的滇重樓種子移接在生根培養基中（MS＋1 mg/L IBA＋3%蔗糖＋0.8%瓊脂粉，pH值為5.6～5.8），生長溫度為（19±2）℃。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 萌發率 種子萌發開始以露出胚芽為起點。萌發率是種子萌發能力最直接的反映，但是并不能全面反映種子的萌發能力，因為它只能反映種子萌發數量的多少，而不能反映種子萌發速率的快慢。

1.3.2 萌發速率指數（GR） 萌發速率指數反映種子萌發速率的快慢，與種子萌發率和萌發時間長短有關，在萌發速率快、萌發歷期短時，其值較大[6]。

其中，Ti為第i天，Gi為第i天的萌發率[7]。

1.3.3 萌發指數（GI）

其中，Gi為逐日發芽粒數，Di為Gi對應的發芽時間[8]。

2 結果與分析

2.1 光照培養和暗培養對滇重樓種子萌發的影響

由表1可知，暗培養滇重樓種子比光照培養效果好，其中，暗培養在第10天就開始萌發（圖1-a）；在第25～30天時為種子萌發高峰期；第35天生長情況良好（圖1-b）；之后由于三七愈傷組織逐漸褐化，導致40 d以后種子不再萌發。光照培養滇重樓種子，最早在第30 d才開始萌發。總體來看，光照培養的萌發結果晚于暗培養。

表1 不同培養條件下滇重樓種子在不同時間段的萌發個數

由表2可知，在三七愈傷組織上進行暗培養滇重樓種子的萌發數要多于光照培養，并且萌發速度要快于光照培養，暗培養平均萌發率為12.5%，平均萌發速率指數為0.014 8；而光照培養的平均萌發率為2.6%，平均萌發速率指數為0.001 1。暗培養的各項萌發指標都高于光照培養，說明暗培養更有利于促進重樓種子的萌發。

表2 滇重樓種子各項萌發指標

2.2 滇重樓生根結果

滇重樓種子的胚根長約1 cm（圖1-b）時，培養瓶中三七愈傷組織已經占據很大空間，為了讓滇重樓更好地生長，將其移接到生根培養基中，大約培養60 d就生根，并可長出真葉（圖1-c）；培養至180 d時，滇重樓生長良好，且根變長增粗，同時根的周圍長出少許愈傷組織（圖1-d）。

3 討論與結論

關于愈傷組織的研究很多，王淑莉等[9]對沙芥葉片愈傷組織誘導進行了研究；李明軍[10]對懷山藥莖段愈傷組織的誘導進行了研究。但未分化的愈傷組織有很強的分裂能力，有很強的活力[11]。種子萌發的基本三要素為光照、水分和溫度，而滇重樓種子屬忌光性、低溫型種子[12-13]。因此，本試驗在（19± 2）℃的溫度下進行暗培養。三七愈傷組織取材廣泛，在山西農業大學組培實驗室中有較多的三七苗，因此，試驗在三七愈傷組織上進行看護培養。根據研究目的選用不同的外植體，一般情況下選用莖作為外植體會取得不錯的效果[14]。本試驗設置了光照培養，是因為生長活躍的愈傷組織才能對種子起作用，光照則可以促進三七愈傷組織的生長，所以設置光照培養來相互對照。試驗結果表明，暗培養優于光照培養，暗培養平均萌發速率指數為0.014 8，光照培養平均萌發速率指數為0.001 1。從萌發速率指數來看，在三七愈傷組織上進行暗培養滇重樓種子的萌發數要多于光照培養，萌發時間較光照培養短。

現階段滇重樓的種植方式主要是根莖繁殖和種子直播。其中，根莖繁殖需占用大量原材料，種子直播發芽率低，但從長遠來看，用種子直播繁殖實生苗是一種經濟實用的方法。因此，采用適宜的方法對滇重樓種子進行處理、提供大量優質的種苗，是滇重樓人工種植過程中較為重要的環節。關于促進滇重樓種子的萌發試驗多采用化學、物理、層積的方法，本試驗用三七愈傷組織培養來促進滇重樓種子的萌發，可以明顯加快滇重樓種子的萌發速度，最快在第10天就開始萌發，萌發高峰期在第20～30天，提前解除滇重樓種子的休眠期，提高了種子的利用率。但平均萌發率僅為12.5%，分析其原因可能有2個，第一，在培養過程中發現三七愈傷組織褐化較快，導致滇重樓種子在三七愈傷組織上培養的有效時間縮短，使萌發率降低，所以尋找更合適的愈傷組織或更好地培養三七愈傷組織還需進一步研究；第二，在去種皮過程中發現，上浮的種子中不乏有大而色深的種子，實為空殼，下沉的種子多數為小而色灰的種子，少數為飽滿色深的種子，而試驗中萌發的種子是飽滿色深的種子，所以，種質也是造成萌發率低的原因。

總體來看，在三七愈傷組織上進行暗培養滇重樓種子，可以明顯加快滇重樓種子的萌發速度，提前解除滇重樓種子的休眠期。有研究表明，在整個萌發過程中，滇重樓種子內源激素GA顯著升高；在滇重樓種子育苗過程中，內源激素ABA和GA起著重要的作用[15]。也有研究表明，看護培養是組織培養中比較有效的方法之一，其可能原因是因為看護細胞向原生質體提供了可促進生長的物質，或提供了一種適宜的密度效應，或吸收原生質體培養過程中產生的有毒物質[16]。本試驗中三七愈傷組織影響滇重樓種子的機制可能是由于釋放一種物質，并且該物質可能具有揮發性；關于本試驗在三七愈傷組織上看護培養滇重樓種子的萌發機制，還有待進一步研究。

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Effects of Callus from Panax notoginseng on Seed Germination of Paris ployphylla Smith var.yunnanensis

SHIYanbi，WUWenjun，LIANGHuihui，QIAOYuqi，WUWenqi，NIUYanbing
（College ofLife Science，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu 030801，China）

Trillium family of Paris polyphylla Smith var.yunnanensis is a perennialherb,with cancer，bleeding and other effects, and broad market prospect,but exists in the actual production of seed germination cycle long and germination rate low.To shorten the seed germination time and increase the germination rate,this experimentcultures the seed of Paris ployphylla Smith var.yunnanensis on callus from Panax notoginseng in lightcircumstance and dark circumstance.The experiment results indicate that the dark culture can significantly shorten the germination time ofthe seed in the callus from Panax notoginseng,the fastestin tenth days to startgermination, germination peak between 20-30 days,the average germination rate was 12.5%.

Paris ployphylla Smith var.yunnanensis;callus from Panax notoginseng;seed germination

R282.71

：A

：1002-2481（2017）09-1438-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.11

2017-03-31

山西省普通高等學校大學創新創業訓練項目（2015109）

石燕碧（1993-），男，山西晉中人，在讀本科，研究方向：中藥資源與開發。牛顏冰為通信作者。