毛木耳多糖對乙醇性肝損傷的保護作用

趙爽+榮成博+張淑曼+劉宇+陳杰

摘要：采用乙醇誘導正常人肝細胞L02形成乙醇性肝損傷的體外模型，通過檢測細胞內甘油三酯（TG）、活性氧（ROS）含量、胞外谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）活性等指標，評價毛木耳多糖提取物對乙醇性肝損傷的的保護作用及機理。結果表明，毛木耳多糖提取物的最佳作用濃度為40 μg/mL時，與模型組相比較，細胞的存活率提高了26.84百分點，細胞內甘油三酯的含量顯著下降，胞外轉氨酶ALT和AST的活性降低。這一結果說明毛木耳多糖提取物能夠提高損傷細胞的存活率，降低乙醇引發的肝內脂肪堆積，減少細胞凋亡，同時游離活性氧的檢測結果顯示毛木耳多糖提取物能夠顯著降低細胞內活性氧的含量，從而可推斷其可能是通過抗氧化途徑發揮防護作用。

關鍵詞：毛木耳；多糖；乙醇性肝損傷；活性氧；胞外轉氨酶

中圖分類號： R284.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0142-03

乙醇進入體內后主要是通過肝臟來完成代謝的，如果攝入的乙醇量過大，細胞色素P450 2E1（CYP2E1）會被誘導表達參與乙醇的代謝，產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS能夠與生物大分子反應造成蛋白變性、酶失活、DNA結構改變、脂質過氧化，從而造成細胞的損傷[1]。大量攝入乙醇不僅引發肝損傷，還會促使乙醇性脂肪肝的形成，并向乙醇性肝炎、乙醇性肝纖維化、肝硬化轉變[2]。據2006年公布的我國首部《中國居民營養與健康之行為和生活方式調查報告》中顯示，我國居民現在飲酒率為21%，這一數字還在不斷上升[3]，乙醇已成為繼病毒性肝炎之后導致肝損害的第二大病因。

食用菌類多糖是一種非特異性免疫促進劑，能增強網狀內皮系統的吞噬功能，提高調整機體免疫功能[4]；研究表明大多數食用菌多糖對各種病毒如流感病毒、單純胞疹病毒等具有抑制作用[5]；研究發現多糖的多種生物活性均與抗氧化性有關，通過緩解疾病、輻射、代謝等引起的氧化應激達到治療和預防腫瘤發生、免疫力低下等疾病[6]。多糖的抗氧化性可能是其多種活性的作用機理之一。毛木耳多糖具有抗氧化[7]、提高免疫[8]、降低血糖血脂[9]等功能，并且可以抑制化學致癌物及促癌物對腫瘤的誘發[10]，因此在保健食品方面具有廣闊的應用前景。毛木耳多糖保護乙醇性肝臟損傷功能研究是一個全新的領域。本研究主要目的是在乙醇性肝損傷模型的基礎上，探索毛木耳多糖提取物保護肝細胞乙醇性損傷的作用，為毛木耳多糖的開發以及深加工食品的研發奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與儀器

細胞株L02，購自中國醫學科學院腫瘤醫院；毛木耳3號菌株，筆者所在實驗室保藏菌株；胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養液、胰酶和雙抗（青霉素和鏈霉素），購自美國Invitrogen公司；MTT測試液，購自美國Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO），購自美國Amresco公司；臺盼藍染液和無水乙醇，購自國藥集團化學試劑有限公司；BCA蛋白質定量檢測試劑盒，購自北京博邁德生物技術有限公司；甘油三酯（TG）酶法測定試劑盒、谷草轉氨酶（AST）測試盒、谷丙轉氨酶（ALT）測試盒和細胞活性氧（ROS）試劑盒，購自南京建成科技有限公司。

MSC-1.2生物安全柜，購自美國Thermo公司；Steti-cycle371 CO2培養箱，購自美國Thermo公司；R-215旋轉蒸發儀，購自瑞士Buchi公司；HYC-360藥品保存箱，購自中國海爾公司；SHZ-88A恒溫水浴鍋，購自北京精科華瑞儀器有限公司；5810R冷凍離心機，購自美國Eppendrof公司；IX-71倒置顯微鏡，購自日本Olympus公司；移液器，購自美國Drummond公司。

1.2試驗方法

1.2.1毛木耳多糖提取物的制備將毛木耳子實體放入高速萬能破碎機進行破碎制備成約100目的均一干粉。稱取50 g干粉，按1 ∶60比例加入去離子水，靜置3 h，利用水浴搖床控制溫度和轉速對混合溶液進行提取，條件控制為 90 ℃、水浴4 h，6 000 r/min離心30 min，取上清，將沉淀物以上述方法再提取1次，合并上清液，利用旋轉蒸發技術濃縮，確定多糖溶液的體積，加入4倍體積的無水乙醇使多糖析出，靜置過夜待固液分離。通過6 000 r/min離心30 min，獲得固體多糖，放至60 ℃的烘箱中烘干直至質量恒定，研磨成粉末狀待用。功能檢測時將多糖粉末配制成500 μg/mL的母液，其中多糖濃度以硫酸-苯酚法測定[11]。

1.2.2乙醇性損傷模型的建立L02細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液（含1%青霉素、鏈霉素混合液）置 37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，待細胞生長至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，調整細胞濃度以 8×103 個/孔的細胞量接種于96孔培養板中，置于37 ℃培養箱中培養至細胞貼壁后，更換培養液，使培養液中乙醇濃度達到1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.5%、3.0%，設置對照組，繼續培養48 h。以MTT方法測定細胞的存活率，以未加入乙醇的空白組作為對照，設定其細胞存活率為100%。

1.2.3毛木耳多糖提取物對乙醇性肝損傷的保護作用

1.2.3.1毛木耳多糖提取物對L02細胞的毒性評價取對數生長期的L02細胞，以8×103個/孔接種于96孔培養板中，待細胞貼壁后，分別加入含多糖的培養液，使終濃度達到0、50、100、200、500、1 000 μg/mL，繼續培養24 h，測定細胞存活率，分析多糖對L02細胞的毒性作用，設定對照組的細胞存活率為100%。

1.2.3.2毛木耳多糖提取物保肝作用細胞以濃度為 8×103 個/孔的接種量置于96孔培養板中，待細胞貼壁后，設置對照組（不加乙醇）和損傷模型組（乙醇終濃度為3%），治療組的細胞中加入終濃度為3%的乙醇和不同濃度的多糖提取物（10、20、30、40、50 μg/mL），37 ℃培養48 h后，測定細胞存活率，設定對照組的細胞存活率為100%。endprint

1.2.3.3肝細胞特征性指標檢測細胞以3×105個/孔接種于6孔培養板中，選用多糖提取物終濃度為40 μg/mL和損傷模型37 ℃培養48 h后，分別收集培養液和細胞，利用胞外谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）試劑盒測定培養液中的酶活力，利用組織甘油三酯測定試劑盒測定TG含量，用BCA法測定蛋白含量，細胞中加入熒光探針，利用組織內活性氧（ROS）測定試劑盒測定ROS的含量。

1.2.4數據統計分析采用SPSS 11.5統計軟件對數據進行處理，試驗結果以“平均值±標準差（x±s）”表示，采用 One-way ANOVA檢驗，P<0.05表示具有顯著性差異。

2結果與分析

2.1肝細胞乙醇性損傷模型

本研究采用正常肝臟細胞株L02為載體細胞，以不同濃度的乙醇作為誘導條件建立損傷模型，評價毛木耳多糖對乙醇性肝損傷的改善作用。以前期建立模型的條件為基礎[12]，檢測乙醇刺激對L02細胞存活率的影響。從表1可知，在單純乙醇因素的刺激下，隨著乙醇濃度增加，細胞存活率明顯下降，從86.59%下降到50.77%，各處理組與對照組比較均達到顯著性差異（P<0.05）。這一檢測結果與之前的研究結果相近，具有良好的重復性，說明此誘導方法能夠建立起穩定的乙醇性肝損傷模型。細胞存活率檢測結果顯示30%乙醇對細胞損傷較大，細胞存活率降低至 50.77%，滿足模型的需求，設定其為模型損傷濃度。

2.2毛木耳多糖提取物細胞毒性檢測

多糖以終濃度0～1 000 μg/mL直接處理細胞，通過MTT檢測發現所有細胞處理組的細胞存活率均在90%以上，且與對照組未達到顯著性差異（P≥0.05），說明毛木耳多糖對

2.3毛木耳多糖提取物的保肝功能

以3.0%乙醇濃度的損傷條件和毛木耳多糖共同處理細胞48 h后發現，不同濃度的多糖均對細胞具有保護作用，但是保護效果并未呈現出劑量的依賴性。圖2顯示的是各濃度多糖對肝細胞的保護作用，其中多糖終濃度為10、20、30、 40 μg/mL 的處理組與模型組比較都能夠顯著性提高細胞存活率。其中多糖終濃度為40 μg/mL時，細胞的存活率最高，為84.79%，與模型組比較提高了26.86百分點，設定其為最佳護肝劑量。

2.4多糖提取物對肝細胞特征指標的影響

本試驗不僅研究了多糖對細胞存活率的影響，同時以TG、胞外AST和ALT的指標反映多糖對肝細胞功能的保護作用。胞內TG含量檢測結果顯示毛木耳多糖提取物具有降低肝細胞中TG的作用，與模型組比較能夠降低76.51%，說明其可以減少乙醇引起的胞內脂肪堆積；胞外轉氨酶的檢測結果發現多糖可以明顯減少ALT和AST的胞外釋放，保護肝細胞的結構完整性。ROS檢測結果顯示多糖提取物能夠降低胞內活性氧的含量，說明毛木耳多糖具有抗氧化的作用，可以減小細胞因氧化而發生的損傷，推斷其是通過抗氧化途徑來發揮護肝功效的。

3結論與討論

乙醇在肝細胞內主要是由乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶催化代謝的，攝入肝內后在脫氫酶和乙醇氧化酶系統作用下被氧化成乙醛，再氧化成乙酸，最后進入三羧酸循環被徹底氧化成CO2和H2O，并釋放出能量[13]。此過程使輔酶不斷轉變為還原型輔酶，二者比例的改變抑制線粒體內三羧酸循環，脂肪氧化減弱，肝內脂肪酸合成增多[14]，最終導致肝臟中脂肪含量升高，因此TG是評價肝損傷的特征指標。從表2可知，48 h后提取物處理組的TG含量較模型組明顯降低，說明毛木耳多糖能夠有效緩解細胞中的脂質沉積作用。

ROS是以氧原子為中心的自由基及其活性衍生物[15-16]，細胞內線粒體是ROS產生的最主要來源[17]。氧化應激與乙醇性肝損傷關系密切，當體內產生的ROS過多，無法被抗氧化物質完全清除時，會發生氧化應激，過量的ROS會與生物大分子反應，造成機體的損傷，甚至導致疾病。從表2可知，經提取物處理48 h后，ROS指標檢測結果表明毛木耳多糖提取物有效改善了肝細胞內的氧化水平。

ALT、AST是反映肝細胞損害情況最常用的酶學檢查指標。AST是一種線粒體酶，乙醇在代謝過程中產生的中間產物乙醛、自由基等，可導致氧應激和脂質過氧化反應，造成線粒體損傷，使大量存在于線粒體的AST進入周圍的循環系統[1]，因此乙醇性肝損傷細胞的培養液中AST升高。ALT主要分布于胞漿，在肝細胞質中有傳輸氨基酸的作用，研究表明僅有1%的肝細胞壞死，就可以使ALT增高1倍，因此，ALT被世界衛生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標[18]。從表2可知，經提取物處理48 h后，ALT和AST的釋放量降低，說明毛木耳多糖提取物能夠保護細胞的完整性，具有保肝的作用。

本研究通過細胞毒性檢測表明毛木耳多糖提取物對肝細胞不具有細胞毒性，其能夠提高肝損傷細胞的存活率，具有保護乙醇性損傷的作用。在多糖作用濃度為40 μg/mL時，細胞存活率與模型組比較可提高26.86百分點，細胞內甘油三酯和ROS的含量分別降低了76.51%和50.15%，培養液中ALT、ASL含量分別降低了35.76%、57.61%。研究結果證明毛木耳多糖不僅對肝細胞具有保護作用，而且可以促進肝細胞行使功能，具有開發應用前景。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.12.038endprint