養殖不同海水魚的同種循環水系統中除磷細菌組成及特性

周勝杰+路斌+賈婷婷+李連星+張揚+劉興+陳成勛+馬志華

摘要：以點帶石斑魚（W池）、大菱鲆（D池）、紅鰭東方鲀（H池）及半滑舌鰨（B池）4個魚種循環水養殖系統凈化池中采集水樣為對象，采用平板分離法及液體培養法定量研究具有除磷能力的細菌及其特性。結果表明，4個系統中共培養16株除磷細菌；其中皮特不動桿菌、哈夫尼希瓦氏菌、創傷弧菌、副溶血弧菌具有較強的除磷能力和效果（皮特不動桿菌>創傷弧菌>哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌）；總除磷能力與細菌總濃度呈正相關；4種細菌去除NH4+-N效果為哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌>皮特不動桿菌>創傷弧菌；其中皮特不動桿菌、哈夫尼希瓦氏菌、創傷弧菌具有除TN能力，去除TN的效果為皮特不動桿菌>哈夫尼希瓦氏菌=創傷弧菌。

關鍵詞：循環水養殖系統；細菌；除磷；氨氮；總氮

中圖分類號： S967.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0120-04

通信作者：陳成勛，研究員，主要從事水產動物增養殖學研究。E-mail：489699261@qq.com。隨著海水集約化養殖模式的發展，餌料投放、養殖密度的提高使水體中營養鹽污染問題突出，為循環水系統磷處理壓力不斷增加。目前，循環水系統中除磷工藝主要靠的是微生物的解磷作用。高效的解磷菌可以有效地緩解集約化循化水系統中的除磷壓力。因此，篩選高效的除磷細菌成為了目前學者們的主要研究熱點。微生物分解環節嚴重受阻，成為水體系統循環過程的制約條件，造成水體富營養化甚至污染，引發出諸多病害、藥殘、食品隱患等問題。當前，對養殖水體除磷方式的研究包括物理法、化學法、植物法（藻類、水草）、微生物學方法[1-6]，其中對不同養殖種類的集約化循環水養殖系統中除磷細菌的種類及多樣性特征的報道較少。本研究以點帶石斑魚、大菱鲆、紅鰭東方鲀和半滑舌鰨4種集約化養殖種類的同種循環水養殖系統作為研究對象，通過分離培養、篩選比較的方式進行除磷菌研究，從而尋找循環水養殖系統中除磷能力較高的除磷菌，了解其多樣性特征，為集約化養殖循環水養殖系統的發展提供參考依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

以天津市海發珍品實業發展有限公司循環水養殖系統凈化池為研究對象，對其中可培養性細菌進行分離提純。

普通可培養性細菌通用培養基：瓊脂15 g、NaCl 5 g、牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、蒸餾水100 mL，121 ℃高溫滅菌15 min。

無機磷液體培養基[7]：NH4Cl 0.50 g、檸檬酸鈉5.66 g、維氏鹽溶液50 mL、蒸餾水100 mL，pH值7.0。

維氏鹽溶液：K2HPO4 5.00 g、MgSO4·7H2O 2.50 g、FeSO2·7H2O 0.05 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、鹽度為1.5%的鹵水。

1.2主要儀器設備

振蕩培養箱（BS-1E型，環宇科學儀器廠）；滅菌鍋（TOMY SX500型，上海麥森醫療科技有限公司）；超凈工作臺（SW-CJ-2FD型，蘇凈安泰）；冷凍離心機（LEGEND MACH 1.6R型，Thermo）；紫外分光光度計（UVmini-1240型，東莞市塘廈眾和電子儀器設備商行）；光學顯微鏡（Leica DM500型，德國萊卡）。

1.3方法將采集到的樣本按10-3、10-4、10-5的濃度稀釋，并取一定量的稀釋液在普通用可培養性細菌培養基上涂布，24 ℃培養16～18 h。通過低倍顯微鏡觀察菌落外形（例如：菌落形狀、菌落顏色、邊緣是否光滑、邊緣線形狀、內部紋理形狀等）將菌落進行分類并標號，統計每1種細菌菌落的數目，推算出濃度。將區分開的菌落通過平板劃線法進行充分分離純化（3～4次），要求每一次都由單菌落進行劃線。將分離純化后的細菌通過16S rRNA進行測序。

利用無機磷液體培養基培養分離出的細菌24 h，測定無機磷含量變化同時測定氨氮與總氮的含量變化，計算其相關性。

1.4統計分析

所得數據在SPSS 19.0及Excel統計軟件上進行處理。結果顯示，細菌濃度、除磷能力、除氨氮能力和除總氮能力4個因素間沒有顯著相關性。而各循環水養殖池細菌總濃度與總除磷能力呈正比（r2=0.999）。

2結果與分析

2.1細菌種類鑒定與系統發育樹分析

DNA分子的制備與分子發育樹的制作參照文獻[8]進行。

16S rRNA測序的通用引物：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。進行PCR擴增，將PCR產物送至測序公司（北京金唯智生物股份有限公司）進行純化和測序。測序獲得的16S rRNA基因序列長度為890～1 500 bp，測序結果在NCBI進行Blast分析。序列對比采用Clustalx的多序列比對排列，系統發育樹采用Mega 5.05的鄰接法。

經普通培養基平板24 ℃培養18～24 h，根據菌落的形態學特征（菌落形狀、顏色、邊緣是否光滑、菌落表面是否光滑、菌落紋路形狀等特點）從點帶石斑魚（W池）、半滑舌鰨（B池）、紅鰭東方鲀（H池）、大菱鲆（D池）4個循環水養殖系統中分離并獲得16S rRNA基因有效序列的細菌16株。利用Blast檢索獲得的16S rRNA基因序列相似性最高的模式菌株，結果發現所有檢測序列均與GenBank中已有的模式菌株16S rRNA基因序列相似性達98.0%以上，為已知菌種，其中相似度在99.0%以上的占 81.3%。分子鑒定與系統發育分析表明，分離到的可培養細菌分別屬于變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）2個門，其中僅農研所芽孢桿菌（Bacillus niabensis）屬于厚壁菌門，其余15株細菌均屬于變形菌門γ-變形菌綱，分別屬于弧菌目（Vibrionales）、假單胞菌目（Pseudomonadales）、交替單胞菌目（Alteromonadales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）4個目菌株數分別為7、5、2、1株，分別占43.8%、32.3%、12.5%、6.3%（圖1）。endprint

2.2可培養性細菌濃度比較

通過平板計數法可知，養殖點帶石斑魚的循環水養殖系統中凈化池中的細菌濃度是最大的，養殖大菱鲆的循環水養殖系統凈化池中的細菌濃度其次，細菌濃度最小的是養殖半滑舌鰨的循環水養殖系統凈化池。濃度最高的細菌為Vibrio ponticus，該細菌與濃度排名第二的約氏不動桿菌存在于養殖點帶石斑魚的循環水養殖系統凈化池中。其中，約氏不動桿菌同時存在于石斑魚和大菱鲆2種循環水養殖系統中。細菌濃度較小的是養殖大菱鲆的循環水養殖系統凈化池和養殖紅鰭東方鲀的循環水養殖系統凈化池，同時，它們也是含有可培養性細菌種類最多的凈化池，均含有5種可培養細菌。在養殖點帶石斑魚的循環水養殖系統凈化池中分離出4株可培養性細菌，分別是Vibrio ponticus、約氏不動桿菌、農研所芽孢桿菌、皮特不動桿菌，分離出可培養性細菌最少的凈化池是養殖半滑舌鰨的循環水養殖系統，僅分離出哈維氏菌和副溶血弧菌2種細菌。濃度最低的可培養性細菌是存在于養殖點帶石斑魚的循環水養殖系統凈化池中的皮特不動桿菌（表1）。

2.3各細菌除磷、氨氮以及總氮性能比較

試驗表明，在W池、D池、H池、B池中均有除磷能力較強的菌，分別是皮特不動桿菌、哈夫尼希瓦氏菌、創傷弧菌、副溶血弧菌，除磷能力分別為44.00%、22.00%、22.30%、2040%，除磷效果為皮特不動桿菌>創傷弧菌>哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌。循環水養殖系統凈化池中各菌株濃度與其除磷、除氮能力顯著相關；凈化池中細菌總濃度與總除磷能力顯著相關。除磷能力強的菌株對除NH4+-N有較強能力，去除NH4+-N能力分別為57.90%、73.90%、33.40%、73.80%；去除NH4+-N效果為：哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌>皮特不動桿菌>創傷弧菌；其中皮特不動桿菌、哈夫尼希瓦氏菌、創傷弧菌具有去除TN的能力，去除率分別為5920%、19.10%、19.10%；去除TN的效果為皮特不動桿菌>哈夫尼希瓦氏菌=創傷弧菌。約氏不動桿菌同時存在于點帶石斑魚和大菱鲆養殖系統中，但是其除磷和去除 NH4+-N及TN的能力均有顯著差異（表1）。

3討論

本研究分離出16株細菌，分別為4株不動桿菌屬（Acinetobacter）、7株弧菌屬（Vibrio）、1株假單胞菌屬（Pseudomonas）、2株希瓦氏菌屬（Shewanella）、1株克呂沃爾菌屬（Kluyvera）、1株芽孢桿菌屬（Bacillus），目前發現的聚磷菌有圓褐固氮菌、枯草芽孢桿菌、硝化桿菌屬、亞硝化桿菌屬、單胞菌屬、假單胞菌屬、節細菌屬、棒狀桿菌屬、有色桿菌屬、微球桿菌屬、分支桿菌屬、芽孢桿菌屬、微桿菌屬等[9-13]。

測試結果表明，在生物濾池內的所有細菌中，濃度最大的細菌并不是除磷、除氮能力最好的細菌，Shewanella seohaensis在養殖大菱鲆的循環水養殖系統中占51.50%，但其實際除磷、除氮能力只有19.00%、0.00%。Wagne等發現不動桿菌屬具有較好的除磷能力，但是對EBPR活性污泥中的不動桿菌屬進行定量分析，發現其數量少于活性污泥微生物種群總量的10%[14-16]。有研究發現，在循環水養殖系統中點帶石斑魚養殖密度高對飼料的需求量較大，對水體潔凈度要求較低，水體中氮、磷含量較高[17-19]，Chrzanowski等發現氮、磷可促進細菌生長，增加細菌的種群密度和均勻度，但優勢種群豐度會降低[20-21]。本試驗結果表明，點帶石斑魚養殖系統中細菌的濃度是4種養殖池中最大的，且可培養性細菌種類較多，系統中細菌種類及密度跟所養殖的魚種類密切相關。

微生物的群落結構與多樣性主要受外界環境影響。養殖環境中的微生物不僅受水體中的餌料、排泄物、溫度、光照等因素影響，而且有研究表明其與腸道微生物有著密切的聯系。Leamaster等研究發現養殖水鹽度會影響魚腸道菌群落結構[22-25]，同時張皓等發現在同種養殖環境中魚的種類不同會導致腸道微生物群落結構不同[26]，凌澤春等發現，養殖魚類腸道微生物菌群與水體中菌群有一定的關系[27]，本研究發現4種魚類的養殖環境均相同（循環水系統、水源、飼料、溫度、光照等），而細菌群落結構與多樣性明顯不同，有可能是受養殖產品的影響，說明養殖魚類對水體中細菌群落結構有一定的影響作用。進一步證明了養殖魚種與養殖水體中群落存在著相互作用關系。

在石斑魚循環水系統中提取出的皮特不動桿菌，經分離培養鑒定為1株聚磷細菌，除磷能力高于其他3株細菌，除磷率達到44.00%，是1株高效除磷細菌。在養殖環境中，可以通過溶磷作用將環境中的不溶或難溶性磷（磷酸三鈣等）轉化為可溶性磷[28]，并通過聚磷作用將無機磷轉化為有機磷，從而為養殖環境中浮游動植物提供營養物質，優化養殖環境。

本試驗樣本來自循環水養殖系統中的凈化池，水中含有較高的磷元素，通過細菌分離、純化得到了16株可培養性細菌，經過液體定量培養基對細菌的除磷能力研究，結果顯示循環水養殖系統凈化池中可培養菌均有一定的除磷能力。試驗表明，在W池、D池、H池、B池中均有除磷能力較高的菌，分別是皮特不動桿菌、哈夫尼希瓦氏菌、創傷弧菌、副溶血弧菌，除磷率分別為44.00%、22.00%、22.30%、20.40%。

經測定半滑舌鰨和大菱鲆的養殖系統中可培養細菌的濃度及總除磷能力均相近。半滑舌鰨和大菱鲆均屬于鲆鰈類，其食性及生存方式相近，故在同等密度飼養及等量投喂餌料時，水體中無機鹽成分和濃度相似，其細菌濃度和總除磷除氮能力也相近[29-30]。試驗結果表明，除磷性能好的菌株對氨氮和總氮有較好的清除能力，細菌的除磷和除氮可能是同時進行的。關于除磷脫氮之間的相互作用還有待于進一步探究。

4結論

（1）循環水養殖系統凈化池中的細菌總濃度：點帶石斑魚>大菱鲆>紅鰭東方鲀>半滑舌鰨，這可能跟不同魚類的消化吸收能力不同有關。共分離出16株可培養細菌。endprint

（2）試驗表明在B池、D池、H池、W池中均有除磷能力較強的菌，分別是皮特不動桿菌、哈夫尼希瓦氏菌、創傷弧菌、副溶血弧菌，除磷效果為皮特不動桿菌>創傷弧菌>哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌。

（3）發現4株除磷能力強的菌株對除NH4+-N也有較強能力，去除NH4+-N效果為哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌>皮特不動桿菌>創傷弧菌；同時具有較好的除TN能力，個別細菌（副溶血弧菌）除外，去除TN的效果為皮特不動桿菌>哈夫尼希瓦氏菌=創傷弧菌。

（4）發現皮特不動桿菌不僅具有反硝化功能及溶磷功能，在本研究中發現還是1株高效除磷細菌。

（5）養殖產品對養殖環境中的微生物有一定的影響作用，該研究結果為集約化工廠化養殖水體的治理提供了有效的菌種資源信息，同時為反硝化除磷技術的應用推廣提供了理論依據。

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