轉(zhuǎn)砂蘚RcMYB基因煙草的抗旱生理指標測定

孫靜+沙偉+張梅娟+賈宇婷

摘要：以轉(zhuǎn)RcMYB基因煙草和野生型煙草為試驗材料，進行干旱和復(fù)水處理，測定不同處理葉片的丙二醛、游離脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖的含量，比較外源RcMYB基因表達對轉(zhuǎn)基因煙草抗旱性的影響。結(jié)果表明，在一定時間范圍內(nèi)，隨脅迫時間的延長，轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量呈上升趨勢但一直低于對照組野生型煙草，脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量均呈上升趨勢并且一直高于對照組野生型煙草；復(fù)水之后，轉(zhuǎn)基因煙草較野生型煙草更快恢復(fù)原有狀態(tài)。結(jié)果表明，砂蘚RcMYB基因在煙草的成功表達，使轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫過程中表現(xiàn)出更強的穩(wěn)定性和恢復(fù)能力，較野生型煙草具有更強的抗旱性。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因；煙草；RcMYB基因；干旱脅迫；生理特性

中圖分類號： S572.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0062-02

干旱已成為全球性的生態(tài)問題，一旦發(fā)生嚴重干旱，會對農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和牧業(yè)的正常運轉(zhuǎn)造成重大影響。目前，植物的抗旱性研究正在逐漸得到關(guān)注和重視，而運用基因工程技術(shù)將抗旱相關(guān)基因轉(zhuǎn)入植物體來提高植物的綜合抗性，成為培育抗逆性新品種的一種重要手段。MYB家族轉(zhuǎn)錄因子是植物中非常重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，在生物體內(nèi)主要起轉(zhuǎn)錄激活作用[1-2]，在植物防衛(wèi)反應(yīng)和逆境脅迫應(yīng)答過程中扮演著非常重要的角色[3]，有著廣泛的生理功能，可引發(fā)一系列生理、生化反應(yīng)，以降低或消除逆境給植株帶來的危害[4]，在植物對環(huán)境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中起著承上啟下的作用。苔蘚植物中的砂蘚具有可以在極干旱環(huán)境下維持生命特征、復(fù)水后立即恢復(fù)正常狀態(tài)的特點，是很好的抗逆基因資源。本試驗研究轉(zhuǎn)砂蘚RcMYB基因煙草對水分脅迫的生理應(yīng)答，旨在為轉(zhuǎn)RcMYB基因煙草的抗旱性研究提供可靠的理論依據(jù)，從而為實現(xiàn)品種的抗性改良奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料為生長狀態(tài)一致的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草。

1.2處理方法

將正常生長的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草進行自然干旱處理15 d，從處理16 d起復(fù)水3 d，分別于0、3、6、9、12、15、18 d取植株葉片進行相應(yīng)的生理指標測定，每個處理3個重復(fù)。

1.3生理指標測定測定

丙二醛含量測定參考趙世杰等的方法[5]；脯氨酸含量測定采用磺基水楊酸法；可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法；可溶性糖含量的測定采用蒽酮法。

1.4數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，Origin軟件繪制圖表。

2結(jié)果與分析

2.1丙二醛含量的變化

丙二醛是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，其積累能對膜脂和細胞造成一定傷害，其含量可反映植物受傷害程度。

從圖1可以看出，在一定時間范圍內(nèi)，隨著脅迫的加劇，轉(zhuǎn)基因型煙草和野生型煙草的MDA含量均呈上升趨勢，最大值分別達到0.33、0.55 μmol/L，為處理前的3.09、4.54倍，在干旱脅迫過程中，野生型煙草中的丙二醛含量高于轉(zhuǎn)基因煙草，并且野生型煙草復(fù)水3 d后，其MDA含量也仍然處于較高的水平，而轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量與脅迫前基本保持一致。

2.2脯氨酸含量的變化

脯氨酸作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物的抗逆生理中發(fā)揮著重要的作用。

從圖2可以看出，在干旱脅迫過程中，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草脯氨酸含量均呈上升趨勢，在處理15 d后達到最大值，分別為0.64、0.40 mg/g，為脅迫處理前的5.3、3.3倍。復(fù)水3 d后，轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量恢復(fù)到脅迫前的1.2倍以內(nèi)，而野生型煙草仍為處理前的1.42倍。

2.3可溶性蛋白含量

可溶性蛋白作為重要的一類蛋白質(zhì)，親水性很強，具有明顯增強細胞的持水力、增加束縛水含量等功能，可抵御干旱帶來的傷害[6]。

從圖3可以看出，在一定時間范圍內(nèi)，隨脅迫時間延長，轉(zhuǎn)基因煙草葉片中可溶性蛋白含量呈明顯的上升趨勢，處理12 d后達到最大值并維持在較高水平。而野生型煙草的可溶性蛋白的含量在脅迫后含量持續(xù)下降，脅迫15 d，其可溶性蛋白的含量僅為處理前的80.6%。復(fù)水3 d后，轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草的可溶性蛋白含量均大致恢復(fù)到脅迫前水平。

2.4可溶性糖含量

可溶性糖是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在干旱脅迫過程中，植物體內(nèi)可溶性糖含量的變化在一定程度上能反映其對不良環(huán)境的適應(yīng)能力。

從圖4可以看出，轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草的可溶性糖含量在干旱脅迫9 d之內(nèi)的變化較為一致。隨著干旱脅迫時間的延長，轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性糖含量持續(xù)上升，于15 d達到最大值，為10.2 mmol/g，野生型煙草的呈先上升后下降的趨勢，于處理9 d達到最大值，為6.9 mmol/g。復(fù)水 3 d 后，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的可溶性糖含量與脅迫前大致相同。

3結(jié)論與討論

丙二醛（MDA）的積累是反映細胞膜脂過氧化作用強弱和質(zhì)膜破壞程度的重要指標，其活性大小代表細胞膜的損傷

程度[7]。覃鵬等發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫使煙草葉片的丙二醛含量顯著升高，復(fù)水一段時間后恢復(fù)脅迫前水平[8]。本試驗中，在一定時間范圍內(nèi)，隨著脅迫時間的延長，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草MDA含量均呈上升趨勢，但轉(zhuǎn)基因煙草的MDA含量始終低于野生型煙草。復(fù)水后轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量較野生型煙草更快地恢復(fù)到脅迫前水平，說明轉(zhuǎn)基因煙草的細胞膜損傷程度明顯弱于野生型煙草。

脯氨酸為植物細胞內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和防脫水劑[9]。有研究表明，隨著干旱脅迫的加劇，葉片脯氨酸積累量與其抗旱性呈正相關(guān)，抗旱性越強，脯氨酸的積累量越高，且變化幅度越大[10-11]。本試驗中，隨著脅迫時間的延長，轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量明顯升高并高于野生型煙草，相同復(fù)水時間處理下，轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量幾乎恢復(fù)到正常水平，野生型煙草脯氨酸含量仍明顯高于處理前。說明在干旱脅迫過程中，轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸較野生型煙草更加積極地參與細胞之間的滲透調(diào)節(jié)作用，維持其穩(wěn)定的滲透壓，對轉(zhuǎn)基因煙草起到更好的保護作用。而野生煙草較轉(zhuǎn)基因煙草對干旱脅迫更加敏感，且恢復(fù)能力較差。

可溶性蛋白作為檢測植物抗旱能力的重要指標，可通過植物體內(nèi)蛋白的合成和降解，使其含量發(fā)生變化[12-13]。可溶性蛋白合成量的增多，可幫助維持植物細胞較低的滲透勢。本試驗中，隨著脅迫時間的延長，轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性蛋白含量均高于野生型煙草，說明轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫發(fā)生的情況下，可提高可溶性蛋白含量，繼而較野生型煙草表現(xiàn)出較強的抗旱能力。

可溶性糖作為一類滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可通過滲透調(diào)節(jié)作用提高植物對逆境的抵抗能力[14-15]。在干旱脅迫下，植物體內(nèi)常常積累大量的可溶性糖，從而增加細胞原生質(zhì)濃度，起到抗脫水的作用。本試驗結(jié)果表明，隨著脅迫時間的延長，轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性糖含量呈上升趨勢，在各個時間點均高于野生型煙草，以較強的滲透調(diào)節(jié)作用來抵抗環(huán)境壓力，表現(xiàn)出良好的抗旱性。而隨著干旱脅迫的加劇，野生型煙草可溶性糖含量呈拋物線變化，說明其在脅迫前期表現(xiàn)出積極應(yīng)對，而后期滲透調(diào)節(jié)能力明顯減弱，說明在脅迫處理期間轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性強于野生型煙草。

綜上所述，15 d的控水對野生型煙草已構(gòu)成脅迫，而轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較好的抗旱性，且在復(fù)水3 d后能基本恢復(fù)到處理前的水平，表現(xiàn)出良好的恢復(fù)能力。在脅迫過程中，轉(zhuǎn)基因煙草的各項指標都明顯優(yōu)于野生型煙草，由此證明，外源endprint