轉基因作物中常見Bt基因PCR檢測方法的建立

邵改革+閆偉+夏蔚+李蔥蔥+龍麗坤+李飛武

摘要：建立基于常見外源基因的轉基因成分檢測方法是開展轉基因生物監測與檢測活動的技術支撐，Bt基因作為目前商業化應用最廣泛的一類外源基因，已成為轉基因產品篩選檢測的重要靶標。依據轉基因作物中常見的6種Bt基因（cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A）的核苷酸序列設計特異性PCR引物，并經過特異性、靈敏度等一系列測試，建立上述6種Bt基因的定性PCR檢測方法。結果顯示，應用這些方法均可從含有相應Bt基因的樣品中正確檢測出預期轉基因成分，方法的靈敏度可達0.10%。上述方法具有特異性強、靈敏度高等特點，適用于轉基因作物中常見Bt基因的篩選檢測。

關鍵詞：轉基因作物；Bt基因；定性PCR方法

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0031-04

與全球轉基因作物商業化蓬勃發展相對應的是人們對于轉基因技術產品的安全性越來越重視。加強轉基因產品監管，已成為世界各國管理轉基因技術的一貫做法，開發行之有效的檢測技術則成了轉基因監管技術支撐機構的一項重要工作[1]。PCR技術兼具特異性強、靈敏度高、結果穩定可靠等優點，在轉基因產品檢測方法研究中被廣泛應用，根據檢測靶標功能的不同，又分為篩選PCR檢測、基因特異性PCR檢測、構建特異性PCR檢測、轉化體特異性PCR檢測4類，其中基因特異性PCR檢測方法以轉基因作物中的外源目的基因為檢測靶標，是一類常見的轉基因產品成分檢測方法[2]。

在已商業化應用的轉基因作物中，抗蟲性是僅次于抗除草劑的第二大性狀，2015年抗蟲轉基因作物種植面積達到 8 370萬hm2（包括單一抗蟲性狀和含有抗蟲的復合性狀），占全球轉基因作物總面積的46.6%[3]。此外，從我國轉基因作物研發進展來看，抗蟲性是第一大目標性狀，除了大規模商業化應用的抗蟲棉花外，也有多種抗蟲轉基因玉米、水稻、大豆新品系進入安全評價階段[4-6]。其中，Bt基因是國內外應用最主要的抗蟲外源基因，包括cry1A、cry2Ab、cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A等。以Bt基因作為檢測靶標的轉基因檢測方法已有諸多報道，Dinon等開發了轉基因玉米MON89034中cry1A.105、cry2Ab2基因的實時熒光PCR方法[7]；李飛武等報道了轉基因作物中cry1Ab、cry2Ab、cry3A等常見Bt基因的單一和多重PCR檢測方法[8]；吳孝槐等建立了轉基因大米中Bt基因的實時熒光PCR方法[9]；Liang等建立了MIR162玉米及COT102棉花中vip3A基因的實時熒光PCR方法[10]；有些Bt基因的PCR檢測方法已成為國家標準或行業標準[11-12]，但未見cry1F、cry1C、cry1Ie等Bt基因檢測方法的報道。

本研究以抗蟲轉基因作物中常見的cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A等6種Bt基因為對象，建立每種基因的定性PCR檢測方法，為轉基因生物安全監管提供有效的技術手段。

1材料與方法

1.1材料與試劑

轉Bt基因玉米TC1507、IE034、59122、MIR162、MON89034、MON810、Bt11、Bt176、Bt38、SK12-5、MON863、MON88017、MIR604，轉Bt基因大豆MON87701，轉Bt基因棉花MON531、MON15985，轉Bt基因水稻T1c-19、G6H1、KF6、KMD、T2a-1、TT51-1，及非轉基因玉米、水稻、大豆、棉花均為筆者所在實驗室保存樣品。將TC1507、IE034、59122、MIR162、T1c-19等量混合后作為陽性對照樣品，將非轉基因玉米、水稻、大豆、棉花等量混合后作為陰性對照樣品。

植物基因組DNA提取試劑盒：北京天根生物技術有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR反應試劑：大連寶生物工程有限公司。

1.2儀器與設備

C1000型PCR儀（美國Bio-Rad公司）；GelDoc XR+凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；ND1000紫外/可見光分光光度計（美國Thermo Fisher公司）。

1.3試驗方法

1.3.1基因組DNA提取按照植物基因組DNA提取試劑盒的操作說明，提取所有樣品的基因組DNA，并使用ND1000分光光度計測定DNA濃度和純度，用1×TE緩沖液稀釋至25 μg/mL，置于4 ℃備用。

1.3.2Bt基因核苷酸序列分析及引物設計根據cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A等6種不同Bt基因的核苷酸序列，使用Primer Premier 5.0（加拿大Premier公司）設計每種基因的特異性PCR檢測引物。引物信息詳見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和純化，用純水配制成10 μmol/L溶液備用。

1.3.3PCR擴增在200 μL PCR管中加入2.5 μL 10×PCR buffer[10 mmol/L Tris-HCl（pH值為8.3）、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2]，2 μL dNTPs混合溶液（每種dNTP的濃度為2.5 mmol/L），1 μL上游引物（10 μmol/L），1 μL下游引物（10 μmol/L），0.2 μL HS-Taq DNA聚合酶（5 U/μL），100 ng DNA模板，用ddH2O補齊至25 μL反應體系。PCR擴增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR擴增結束后，取5 μL擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。endprint

2結果與分析

2.1轉Bt基因作物及其外源基因檢測引物篩選

商業化轉基因作物數據庫（ISAAA GM Approval Database）、美國農業部動植物衛生檢驗局網站（USDA APHIS）及國內外專利庫等渠道發布的數據顯示，Bt基因是當前全球抗蟲轉基因作物中應用最為廣泛的一類外源基因，包含cry1F、cry1C、cry1Ie等在內的10余種基因。本研究收集了我國已批準的國外抗蟲轉基因作物及國內自主研發的重要抗蟲轉基因作物轉化體共22種，包括轉基因玉米、大豆、棉花、水稻，各個轉化體的Bt基因種類詳見表2。針對cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A等6種Bt基因的序列，分別設計了一系列PCR檢測引物，進行適用性測試，最終確定了每種Bt基因的PCR檢測引物（表1）。表2轉Bt基因作物信息

2.26種Bt基因的PCR檢測方法特異性測試

以22種轉Bt基因作物和1種非轉基因作物混合物（含有非轉基因玉米、大豆、水稻、棉花）作為試驗材料，分別對6種Bt基因的PCR檢測方法進行特異性測試，結果如圖1所示。應用cry1F基因檢測方法僅能從陽性對照及TC1507玉米樣品中獲得與預期大小一致的擴增產物（泳道27～28），同樣應用其他5種基因檢測方法也僅能從含有相應基因的樣品中獲得預期擴增產物，而在其他轉基因試驗材料、非轉基因作物陰性樣品、空白對照中均未出現擴增產物，說明這6種Bt基因檢測方法均表現出對靶標基因的嚴格特異性。

2.36種Bt基因的PCR檢測方法靈敏度測試

分別將TC1507玉米、T1c-19水稻、IE034玉米、59122玉米、MIR162玉米與非轉基因作物樣品按質量比進行混合，制備成相應轉化體的質量分數分別為10.00%、5.00%、100%、0.50%、0.10%、0.05%、0.01%的梯度樣品，提取DNA進行對應Bt基因檢測方法的靈敏度測試，結果如圖2所示。應用cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab基因的PCR檢測方法均可從轉基因含量為0.05%的樣品中擴增出與預期大小一致的特異性產物，而應用cry35Ab、vip3A基因的PCR檢測方法可從0.10%轉基因樣品中獲得預期擴增，表明針對6種Bt基因檢測方法的檢出限均可達到0.10%，能夠進行相應轉基因產品的高靈敏檢測。

3結論與討論

轉基因作物及其產品種類的不斷增多給轉基因檢測工作帶來了一定的挑戰，選擇代表性高、覆蓋面廣的檢測靶標，并建立精準高通量的檢測方法，成為轉基因檢測技術研究的重要方向[13]。Bt基因作為一類應用廣泛的外源基因，非常適合作為篩選檢測的靶標，cry1Ab、cry2Ab、cry3A等基因的檢測方法也已經被開發出來[14-16]，而針對cry1F、cry1C、cry1Ie等Bt基因的檢測方法尚未見報道。

本研究針對抗蟲轉基因作物中cry1F、cry1C、cry1Ie、

cry34Ab、cry35Ab、vip3A等6種常見Bt基因，通過引物設計與篩選、特異性測試、靈敏度測試等步驟， 建立了能準確檢測上述Bt基因的PCR檢測方法，上述方法的檢測靈敏度均可達到0.10%，為轉基因作物的篩選檢測提供了方法支持。此外，將這些方法與預制PCR、多重PCR等技術結合，還可建立更加快速、便捷、高效的轉基因檢測方法，更好地應用于轉基因產品成分檢測工作。

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