種羊布病虎紅平板凝集與競爭ELISA檢測的對比分析

劉艷琴 柴貴明 梁莉 劉宗益/內蒙古巴彥淖爾烏拉特中旗農牧業局動物疫病預防控制中心

韓文芳/內蒙古巴彥淖爾市動物疫病預防控制中心

范艷麗 丁博/ 內蒙古巴彥淖爾五原縣動物疫病預防控制中心

種羊布病虎紅平板凝集與競爭ELISA檢測的對比分析

劉艷琴 柴貴明 梁莉 劉宗益/內蒙古巴彥淖爾烏拉特中旗農牧業局動物疫病預防控制中心

韓文芳/內蒙古巴彥淖爾市動物疫病預防控制中心

范艷麗 丁博/ 內蒙古巴彥淖爾五原縣動物疫病預防控制中心

布魯氏菌病（Brucellosis），簡稱布病，是由布魯氏菌屬（brucellosis）細菌引起人與動物共患的變態反應性傳染病，嚴重地威脅著人類健康和畜牧業經濟。歷史上，布魯氏菌病在我國曾經是危害極為嚴重的人獸共患傳染病之一。解放后，布魯氏菌病的防治得到高度重視，被列為二類法定傳染病。

從我國不同年代家畜布病感染狀態分析，在上世紀50-60年代家畜感染布病明顯高于70-80年代，自70年代后開始下降，80年代末期已下降到有史以來的最低點，90年代初期平均感染率除羊外，牛和豬都達到我國規定的控制標準。布魯氏菌病的防控始于50年代中期，我國始終重視布魯氏菌病的防治工作，有組織有計劃的進行人畜布魯氏菌病流行病學調查。然后是60、70年代對高危家畜進行疫苗防治，發病率明顯下降，取得了顯著成果。

在上世紀50、60年代時烏拉特中旗發生過布病，但由于各級政府及業務部門高度重視布病防治工作，堅持畜間防治以免疫為主，免、檢、監測、淘汰陽性畜相結合的綜合防控措施，至上世紀90年代，布病基本得到了控制。進入本世紀以后，隨著加大農牧業結構調整力度，巴彥淖爾烏拉特中旗旗又是畜牧業大旗，畜牧業地位不斷提升，農牧民養殖態度積極，外購牲畜比重逐年增加。由于牲畜購入渠道繁多，流通監管難，導致周邊及外來牲畜流入巴彥淖爾烏拉特中旗旗引發布病疫情。

隨著當今世界的國際化貿易，布病的檢測和監測工作已成為貿易流通中極其重要的一個環節。雖然國際獸醫局（OIE）編寫了動物傳染病的診斷方法及疫苗標準手冊已統一各成員國檢測方法及結果差異，不同實驗室間，即使用同一份血清，由于條件差異或者用不同的方法檢測所得結果也會有所差異，在實際檢測過程中還有很多問題值得探討。因為在布病防控工作中，政府要投入大量的人力、財力、物力進行實驗室檢測、撲殺補貼，因此，選擇合理、可靠的檢測方法，科學準確的做出結果，才能最終達到有效控制布病的效果，避免在撲殺過程中誤殺、漏殺，進而減少農牧民的經濟損失。

一、材料和方法

1.種羊。巴彥淖爾烏拉特中旗地區的兩個種羊場的115只種羊全部進行監測，所有檢測羊均未接種過S19疫苗或口服豬2號疫苗。

2.試劑。布魯氏菌虎紅平板試驗抗原，中國獸醫藥品監察所生產，批號20161003，規格15 ml/瓶，陰性血清，陽性血清。布魯氏桿菌抗體競爭ELISA檢測試劑盒，北京維德維康生物技術有限公司生產，規格96T×2/盒。

3.方法。布魯菌病抗體檢測按照中華人民共和國國家標準（GB/ T18646-2002）操作，布魯菌抗體檢測按照ELISA檢測試劑盒的說明書進行操作。采用5 ml一次性采血器，每只羊頸靜脈采血2～3 ml，分離血清后進行虎紅平板凝集試驗(RBPT)。同時將所采血清用競爭ELISA（cELISA）試劑盒進行檢測。所有的血清樣品用兩種方法進行對比檢測，以確定RBPT與c-ELISA檢測結果的符合率。

二、結果與分析

1.總體情況。

本次實驗室共檢測血清115頭份，RBPT陽性頭數46頭份，RBPT陽 性 率40%；c-ELISA陽性頭數23頭份，c-ELISA陽性率20%。

其中種公羊46頭份，RBPT陽性血清13頭份，布病虎紅陽性率28.26%；檢測種母羊69頭份，RBPT陽性血清33頭份，布病虎紅陽性率47.83%。

c-ELISA共檢測115頭份，其中種公羊46頭份，c-ELISA陽性血清8頭份，布病c-ELISA陽性率17.39%；檢測種母羊69頭份，結果的符合率為50%，競爭ELISA更準確，RBPT的假陽性率達到50%。種母羊的血清進行RBPT檢測時，33份RBPT陽性血清c-ELISA僅確認了15份陽性。試驗中發現，這部分羊血清進行RBPT時弱陽性的數量比較多，血清與抗原混合以后3～5min后，才會顯現出極細小的顆粒，在進行ELISA確認時測得結果為陰性，RBPT為陽性。從而也表明RBPT受人為判定標準的影響是比較大的，假陽性率較高。

三、討論與結論

1.血清學診斷是診斷布魯菌病的主要手段，且血清學診斷方法較c-ELISA陽性血清15頭份，布病c-ELISA陽性率21.74%。

2. RBPT與競爭ELISA檢測結果比較。

69頭份RBPT陰性血清中，競爭ELISA檢測陽性數為2，陽性率2.9%，分析有可能是患畜初期感染布病，抗體未達到RBPT檢測的含量，RBPT檢出陰性；c-ELISA的敏感性高，檢出2份陽性血樣。RBPT及競爭ELISA檢測結果比較見表2。

表1 虎紅平板凝集試驗（RBPT）及競爭ELISA檢測結果

表2 虎紅平板凝集試驗（RBPT）及競爭ELISA檢測結果比較

從整體檢測結果看，兩種試驗多，尤其RBPT是目前我國基層單位群體篩查的主要檢測方法。但血清學檢測方法存在兩個方面問題：一是血清學假陽性反應，原因是由于某些革蘭氏陰性細菌感染，如小腸結腸耶爾森0:9，大腸桿菌0：157等，這些細菌表面的脂多糖O鏈抗原與光滑型布魯菌表面脂多糖有交叉的抗原結構（C/Y）;二是免疫動物血清中的抗體干擾常規血清學檢測，造成誤判結果，導致巨大經濟損失。研究表明傳統的血清學方法和間接ELISA均無法排除假陽性反應，競爭ELISA(c-ELISA)可以排除血假陽性反應。用ELISA檢測布魯菌病是一項新技術，1976年 Cavleson等是最先應用ELISA檢測牛布病抗體并發現其敏感性比試管凝集試驗高10～100倍。目前世界上比較成熟的檢測布病的ELISA方法包括競爭ELISA(cELISA)和間接ELISA（iELISA）兩種，iELISA的敏感性較高，cELISA的特異性較高，可以排除其他革蘭氏陰性菌引起的假陽性反應。

2.本實驗采用的RBPT的優點是易操作、簡單，缺點是存在假陽性反應，特異性差，且存在人為判定因素影響 ，本實驗結果表明RBPT的假陽性率在50%，這與曹杰，齊長明等人的試驗結果40%～50%基本一致。在結果判定時，凡凝集反應緩慢、顆粒細小的，應判為可疑(+)。有實驗證明，虎紅平板凝集試驗、和試管凝集試驗這兩種診斷方法都會出現較高比例的假陽性和假陰性。

3.由于實驗動物數量有限，該實驗結果只能初步說明問題，我們下一步將進行大批量動物試驗，以期獲得更加可靠的數據。雖然說布病檢測的血清學方法比較多，但目前還沒有一種檢測方法是在敏感性、特異性、準確性還是快速簡便等方面都兼顧的診斷方法。有結果表明ELISA操作方便，具有較好的敏感性和特異性，建議在檢疫中用敏感性較高的RBPT初篩，用特異性較好的ELISA確診，以得到較好的效果。由于陽性畜的漏檢，為擴散蔓延病原提供了條件，陰性畜的誤殺又會造成不必要的經濟損失，所以大規模檢疫時，可以用價格低廉、敏感性強、操作簡單的方法先初篩，然后用敏感性、特異性好的診斷方法復檢。

（略）