HPLC法同時測定風濕定片中甘草酸和歐前胡素的含量

曾上敏，秦斯民，曹華玲

(廣東食品藥品職業學院，廣東 廣州 510520)

HPLC法同時測定風濕定片中甘草酸和歐前胡素的含量

曾上敏，秦斯民，曹華玲

(廣東食品藥品職業學院，廣東 廣州 510520)

建立HPLC同時測定風濕定片中甘草酸和歐前胡素含量的方法。采用反相高效液相色譜法，色譜柱為Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.05%甲酸水溶液，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為254 nm，柱溫為25℃。甘草酸在0.92～18.4 μg·mL-1(r=0.9996)，歐前胡素在0.496～9.92 μg·mL-1(r=0.9998)范圍具有良好的線性關系；平均回收率甘草酸為98.5%，RSD為2.97%(n=6)；歐前胡素為99.4%，RSD為1.20%(n=6)。本方法準確，操作簡便、重復性好，可用于風濕定片的質量控制。

風濕定片；HPLC；甘草酸；歐前胡素

風濕定片是由八角楓、白芷、徐長卿、甘草4味中藥組成，具有散風除濕，通絡止痛之功效。用于風濕阻絡所致的痹病，癥見關節疼痛；風濕性關節炎，類風濕關節炎，肋神經痛，坐骨神經痛見上述證候者[1]。2015年版中國藥典(一部)對風濕定片中徐長卿的主要成分丹皮酚進行了含量測定，鑒別采用薄層鑒別法[1]。同時，也有文獻報道采用HPLC法測定風濕定片中毒藜堿的含量[2]。白芷和甘草也是該制劑的主要成分，藥典中未對白芷和甘草的主要成分歐前胡素和甘草酸進行含量測定[3-4]，也未見國內有采用HPLC法對風濕定片中歐前胡素和甘草酸的含量進行單獨或同時測定的文獻報道。為更全面評價風濕定片的質量，本研究建立了HPLC法同時測定風濕定片中甘草酸和歐前胡素2個有效成分含量的方法，為風濕定片的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

LC-15C高效液相色譜儀(日本島津公司，包括LC-15C雙元泵， SPD-15C紫外檢測器，SIL-10AF自動進樣器，LC-solution工作站。Mettler AE-240電子分析天平；超純水器(Millipore)；超聲波清洗器(KQ-400DB，昆山市超聲儀器有限公司)。

甘草酸銨對照品(批號：110731-201619，含量以93.0%計，每1mg甘草酸銨相當于0.9795mg甘草酸)、歐前胡素(批號：110826-201415)，由中國藥品生物制品檢定所提供；風濕定片(陜西君碧莎制藥有限公司，批號為20110801、20111001、20120601)；乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純，水為超純水。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil -C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.05%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫0～10min，35%A；10～15min，35%A→45%A；15～20min，45%A→55%A；20～30min，55%A。流速：1.0mL·min-1；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取甘草酸銨及歐前胡素對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含甘草酸及歐前胡素分別為0.46 mg·mL-1、0.248 mg·mL-1的混合對照品儲備溶液。精密量取混合對照品儲備液5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10片，研細，精密稱取細粉0.20 g，置于50 mL量瓶中，加75%甲醇適量超聲處理30min，冷卻，定容至至刻度，搖勻，濾過，即得[5-6]。

2.4 陰性對照品溶液制備

按處方比例模擬制作缺白芷或甘草的陰性對照品，按2.3項下方法制得陰性對照品溶液。

3 實驗結果

3.1 系統適用性試驗

A：對照品 B：樣品 C：缺甘草陰性對照品；D缺白芷陰性對照品

按2.1項下色譜條件，分別取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液10 μL進樣。在此條件下，甘草酸和歐前胡素的理論板數大于4000，樣品、對照品、陰性對照品色譜圖見圖1。

3.2 線性關系考察

精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液0.5、1、2、5、10 mL，置25 mL量瓶中，分別甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備成甘草酸濃度為0.92、1.84、3.68、9.20、18.4μg·mL-1及歐前胡素濃度為0.496、0.992、1.984、4.96、9.92μg·mL-1系列混合對照品溶液。按2.1項下色譜條件進樣測定，以濃度C(μg.mL-1)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，計算回歸方程：甘草酸Y=2.2066×105C-8.6503×104，r=0.9996，在0.92～18.4 μg·mL-1內有良好線性關系；歐前胡素Y=1.02128×105C+5.4336×104，r=0.9998，在0.496～9.92 μg·mL-1內有良好的線性關系。

3.3 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續進樣6次，甘草酸和歐前胡素峰面積的RSD分別為1.08%和0.96%，表明儀器精密度良好。

3.4 重復性試驗

取同一批號樣品6份，按2.3項下方法制備供試品溶液，按 2.1項下色譜條件進行測定，甘草酸和歐前胡素平均含量分別為2.1646 mg·g-1和0.2876 mg·g-1，RSD分別為1.29%和1.12%，表明方法重復性良好。

3.5 穩定性試驗

取0、2、4、6、8、12、24 h供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，結果甘草酸和歐前胡素峰面積RSD分別為1.45%和1.35%，供試品溶液在24 h內穩定。

3.6 加樣回收試驗

精密稱取6份風濕定片(批號20110801)樣品置于50 mL量瓶中，每份約0.1 g，分別加入一定量的甘草酸銨和歐前胡素對照品，按2.3項下方法制備供試品溶液，結果見表1。

表1 風濕定片中甘草酸和歐前胡素加樣回收率試驗結果

3.7 樣品測定

分別精密稱取0.2 g三批風濕定片樣品，每批3份，按2.3項下方法制備供試品溶液，照2.1項下色譜條件測定，對三批風濕定片中甘草酸和歐前胡素進行含量測定，結果見表2。

表2 三批風濕定片中甘草酸和歐前胡素的含量

4 討論

4.1 檢測波長的選擇

采用紫外掃描發現甘草酸在250 nm和360 nm有最大紫外吸收，歐前胡素最大吸收波長有300、254、248 nm，選擇254 nm進行檢測時兩種化合物的峰面積及峰高值均較大且各峰峰形良好，基線平穩，分離較好，因此選擇254 nm為檢測波長。

4.2 流動相的選擇

在流動相的選擇中，選擇了甲醇-水、甲醇-0.05%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液乙腈-水、乙腈-0.05%甲酸水溶液及乙腈-0.1%甲酸水溶液系統進行比較，發現乙腈-0.05%甲酸水溶液為流動相時目標化合物色譜峰對稱性好且基線平穩，因此最終確定以乙腈-0.05%甲酸水溶液為流動相[7-8]。

4.3 提取方法的選擇

在提取方法的選擇上，以《中國藥典》2015年版一部甘草和白芷[含量測定]項下樣品的提取條件為參考，分別對提取超聲時間及提取溶劑進行優化[9-10]。考察了50%甲醇、75%甲醇、甲醇及50%乙醇、75%乙醇、無水乙醇分別在超聲15min、30min、45min及60min對2個成分的影響，當采用75%甲醇作為提取溶劑，超聲30min是提取效率較高[11-12]，再延長提取時間兩種化合物的量并沒有明顯差異，因此選擇提取條件為75%甲醇超聲提取30min。

本研究采用高效液相色譜法，建立了同時測定風濕定片中甘草酸和歐前胡素含量的方法，該方法簡便、快速、準確度高，重復性好，為評價風濕定片的質量提供依據。

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(本文文獻格式：曾上敏，秦斯民，曹華玲 .HPLC法同時測定風濕定片中甘草酸和歐前胡素的含量[J].山東化工,2017,46(11):98-100,103.)

Simultaneous Determination of Glycyrrhizic Acid and Imperatorin in Fengshiding Tablets by HPLC

ZengShangmin,QinSimin,CaoHualing

(Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangzhou 510520,China)

To establish a method for determinate Glycyrrhizic acid and Imperatorin in Fengshiding Tablets by HPLC simultaneously.The Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm, 5μm) chromatographic column was used with a mobile phase of acetonitrile-0.05% formic acid by gradient elution, the detection wavelength was at 254 nm, the column temperature was 25℃, and the flow rate was 1.0 mL·min-1.The linear ranges of Glycyrrhizic acid and Imperatorin were 0.92～18.4 μg·mL-1(r=0.9996), 0.496～9.92 μg·mL-1(r=0.9998) respectively. Average recoveries of two components were 98.5% with RSD 2.97% and 99.4% with RSD 1.20% respectively.The method was simple, sensitive and repeatable, could be used for the quality control of Fengshiding Tablets.

Fengshiding tablets; HPLC; glycyrrhizic acid; imperatorin

2017-03-31

曾上敏(1988—)，男，助教，從事藥物制劑方面的研究。

O657.7

A

1008-021X(2017)11-0098-03