全氟辛烷磺酸與載脂蛋白AⅠ非共價鍵復(fù)合物的質(zhì)譜分析實驗探究

謝 東，劉 林，王 獻(xiàn)

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

分析與測試

全氟辛烷磺酸與載脂蛋白AⅠ非共價鍵復(fù)合物的質(zhì)譜分析實驗探究

謝 東，劉 林，王 獻(xiàn)*

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

本文采用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)方法，分析研究了載脂蛋白AⅠ(Apo AⅠ)、全氟辛烷磺酸(PFOS)與Apo AⅠ結(jié)合的最佳實驗條件和儀器參數(shù)。探討了電噴霧離子源溫度和碎裂電壓對Apo AⅠ蛋白質(zhì)多電荷質(zhì)譜峰信號的影響，以及在最佳儀器條件下(電噴霧離子源溫度為200 ℃，碎裂電壓為175 V)，獲得了PFOS-Apo AⅠ形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物質(zhì)譜譜圖。在該條件下，Apo AⅠ最多能與PFOS形成化學(xué)計量比為1：4的蛋白質(zhì)復(fù)合物。

電噴霧質(zhì)譜；載脂蛋白AⅠ；全氟辛烷磺酸；蛋白質(zhì)復(fù)合物

全氟化合物由于具有良好的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和生活的各個方面，其存在于半導(dǎo)體的制造及廚具涂料、紡織品等表面活性劑、表面保護(hù)劑中[1-2]。但近幾年研究報道稱，以全氟辛酸和全氟辛烷磺酸及其鹽類為代表的全氟化合物具有持久性、高度生物累積性、生物體多臟器等毒性[3-4]。在中國各地區(qū)的人血漿檢測中，沈陽地區(qū)PFOS的含量最高，達(dá)到79.2 ng/mL，天津地區(qū)的含量最低為3.72 ng/mL[5]。Dallaire等人[6]發(fā)現(xiàn)這些多鹵化物會改變甲狀腺素水平。Nelson等人[7]報道全氟化物會擾亂脂質(zhì)和體重的調(diào)節(jié)，使低密度脂蛋白含量增高，同時PFOS的暴露會導(dǎo)致總膽固醇含量高達(dá)13.4 mg/dL。

載脂蛋白AⅠ(Apo AⅠ)是高密度脂蛋白(HDL)的主要成分[8]。在生命體的生理作用中，Apo A I不僅能識別和穩(wěn)定HDL受體蛋白，并且在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的相關(guān)酶的活性上，發(fā)揮著極其重要的作用[9-10]。雖然研究表明，全氟類化合物能與脂肪酸運載蛋白結(jié)合[11]，但有關(guān)全氟類化合物與載脂蛋白的相互作用的質(zhì)譜研究還鮮有報道。本文采用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)軟電離技術(shù)檢測了PFOS與Apo AⅠ形成的非共價鍵復(fù)合物，探索了檢測PFOS-Apo AⅠ蛋白質(zhì)復(fù)合物的最佳實驗條件。通過優(yōu)化ESI離子源的儀器參數(shù)，盡可能地保持蛋白質(zhì)與配體分子的弱相互作用，同時獲得最佳的質(zhì)譜信號強(qiáng)度，是實驗成功的關(guān)鍵。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

載脂蛋白AⅠ(Apo AⅠ，85%，美國Sigma公司)；乙酸銨(99.0%，阿拉丁公司)；冰醋酸(分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(色譜純，美國Waltman公司)；全氟辛烷磺酸(200 μmol·L-1，美國Sigma公司)。

6520 ESI Q-TOF-MS液相色譜-質(zhì)譜分析儀(美國Agilent公司)；GL-20高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀器離心機(jī)有限公司)；Milli-Q Advantage A10數(shù)位超純水系統(tǒng)Type Ι(美國Millipore公司)；FE20實驗室pH計(梅勒特-托利多儀器上海有限公司)；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科興儀器廠); FA1004電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 溶液配制

配制pH值6.9醋酸銨緩沖溶液溶解 Apo AⅠ樣品至所需濃度，和蛋白質(zhì)與PFOS的濃度比為1∶1，1∶2，1∶4，1∶6，1∶8的一系列待測溶液，每一濃度下平行重復(fù)3次，最終蛋白質(zhì)濃度為2.5 μmol·L-1。將配制好的混合溶液均放置在37 ℃的恒溫水浴鍋中恒溫孵育30min，然后進(jìn)行ESI-MS的檢測。

1.3 儀器條件

型號6520的ESI-Q-TOF MS儀器模式采用正離子模式進(jìn)行檢測，樣品以標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣方式采取自動進(jìn)樣。液相色譜的流動相為超純水，儀器采集范圍600～3800 m/z。在一定的干燥氣溫度、碎裂電壓，設(shè)置干燥氣流速為8 L·min-1，噴霧器壓力65 psig，毛細(xì)管電壓3500 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 Apo AⅠ蛋白的ESI-MS實驗條件摸索研究

2.1.1 電噴霧離子源溫度的影響

圖1 不同離子源溫度下的Apo AⅠ的ESI-MS質(zhì)譜圖

在保持其他條件不變的情況下，ESI-MS檢測了不同的離子源溫度對Apo AⅠ蛋白質(zhì)的多電荷離子分布圖譜，如圖1所示，分別對應(yīng)離子源溫度為200，250，275，300℃的質(zhì)譜譜圖。Apo AⅠ信號較強(qiáng)的離子峰多電荷分布區(qū)域主要包括+11至+15，和+21至+35。高質(zhì)荷比區(qū)的離子峰，蛋白質(zhì)所帶電荷數(shù)較少，即反映了天然狀態(tài)下結(jié)構(gòu)較緊致的蛋白質(zhì)構(gòu)象，而蛋白質(zhì)去折疊后所帶電荷數(shù)增加，主要形成低質(zhì)荷比分布的離子峰。當(dāng)離子源溫度升高至275℃時，電荷分布為+11至+15的離子峰信號強(qiáng)度較250℃時低，因此250℃比275℃的條件下更能反映蛋白的自然狀態(tài)。當(dāng)溫度升高至300℃時，僅存在部分自然態(tài)狀態(tài)下的多電荷峰，并且整體向低質(zhì)荷比區(qū)偏移，表明絕大多數(shù)蛋白質(zhì)已經(jīng)解離。因此，在溫和的溫度下更利于檢測未解離狀態(tài)下的蛋白質(zhì)。但在200℃的溫度下質(zhì)譜檢測到的多電荷峰強(qiáng)度反而較低，可能由于溫度較低影響去溶劑化效果，造成樣品的離子化效率降低，靈敏度下降。

2.1.2 電噴霧碎裂電壓的影響

圖2 不同碎裂電壓下的Apo AⅠ蛋白的ESI-MS譜圖

電噴霧質(zhì)譜的碎裂電壓是影響蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物多電荷分布的另一關(guān)鍵因素。改變碎裂電壓分別為175、200、250 V，如圖2可見，當(dāng)裂解電壓逐漸增加，電荷分布為+11至+15的自然態(tài)下蛋白質(zhì)多電荷峰的信號強(qiáng)度和個數(shù)都有明顯降低。這是由于溫和的碎裂電壓更利于檢測未解離狀態(tài)下的蛋白質(zhì)多電荷峰。綜合多電荷峰個數(shù)及信噪比可知，在碎裂電壓為175 V時，為蛋白質(zhì)檢測的最優(yōu)條件。

2.2 PFOS與Apo AⅠ蛋白復(fù)合物的ESI-MS檢測

上述Apo AⅠ空白蛋白質(zhì)譜條件的優(yōu)化，為PFOS與Apo AⅠ復(fù)合物的檢測提供了參考。在其他條件不變的情況下，選取在不同離子源溫度及碎裂電壓下進(jìn)行檢測PFOS-Apo AⅠ的復(fù)合物峰(離子源溫度和碎裂電壓分別為：200℃、225℃、250℃；175V、200V、250 V)。當(dāng)離子源溫度為200 ℃時， Apo AⅠ能與4個PFOS結(jié)合形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。隨著溫度的增高，配體結(jié)合數(shù)目及復(fù)合物峰強(qiáng)度均有降低，這是由于較高溫度導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，從而不利于與配體形成穩(wěn)定的復(fù)合物峰。同時，考察了碎裂電壓的影響，在175 V時的質(zhì)譜信號最強(qiáng)，是由于在較溫和的碎裂電壓下更利于檢測蛋白質(zhì)復(fù)合峰。對比復(fù)合物的結(jié)合峰強(qiáng)度及結(jié)合配體的個數(shù)可知，200 ℃、175 V更適合檢測PFOS-Apo AⅠ非共價鍵復(fù)合物，見圖3。

A)干燥氣溫度200 ℃；B)碎裂電壓175 V； C) 干燥氣溫度225 ℃；D) 碎裂電壓200 V；E)干燥氣溫度250 ℃；F)碎裂電壓250 V

圖3 Apo AⅠ與PFOS配體分子的ESI-MS譜圖

Fig.3 ESI-MS spectra under optimal conditions for the solution of Apo AⅠand PFOS at 1:4 molar concentration ratio

3 結(jié)論

由于分析檢測非共價鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物，需要盡可能地保持蛋白質(zhì)與配體的弱相互作用，又要保證較高的靈敏度以獲得最強(qiáng)的質(zhì)譜信號，因此實驗條件的探索對PFOS-Apo AⅠ的檢測十分關(guān)鍵。本文分別探索了自然態(tài)的Apo AⅠ蛋白質(zhì)，以及PFOS-Apo AⅠ復(fù)合物質(zhì)譜檢測的最佳條件。PFOS-Apo AⅠ復(fù)合物ESI-MS檢測的最佳條件為：離子源溫度200 ℃，碎裂電壓175 V，進(jìn)樣體積為5 μL。Apo AⅠ最多能結(jié)合4個PFOS配體分子，分別形成化學(xué)計量比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的蛋白質(zhì)復(fù)合物。

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(本文文獻(xiàn)格式：謝 東，劉 林，王 獻(xiàn).全氟辛烷磺酸與載脂蛋白AⅠ非共價鍵復(fù)合物的質(zhì)譜分析實驗探究[J].山東化工,2017,46(11):88-90.)

Mass Spectrometric Analysis of Noncovalent Protein Complex of Perfluorooctane Sulfonic Acid and Apolipoprotein AⅠ

XieDong,LiuLin,WangXian*

(College of Chemistry and Material Science,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074，China)

In this work,we have analyzed apolipoprotein AⅠ (Apo AⅠ),and the protein complex of Apo AⅠcombined with perfluorooctane sulfonic acid (PFOS) by electrospray mass spectrometry (ESI-MS),The key parameters of ESI-MS and experiment conditions have been optimized. The effects of source temperature and fragmentor voltage on Apo AⅠESI-MS spectra have been explored. Under the optimal experiment conditions (i.e. electrospray ion source temperature at 200 ℃,fragmentor voltage at 175 V),we have detected the s
Table protein complex of PFOS and Apo AⅠ. Results showed that at this conditions,Apo AⅠcan combined with PFOS at an maximal stoichiometric ratio of 1∶4.

electrospray mass spetrometry; apolipoprotein AⅠ;perfluorooctane sulfonic acid;protein complex

2017-04-14

國家自然科學(xué)基金項目(21675176，21275167)；湖北省自然科學(xué)基金項目(2014CFA025)

謝 東(1992—)，女，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向為分析化學(xué)；王 獻(xiàn)(1978-)，女，湖北武漢人，博士，教授，主要從事質(zhì)譜分析研究。

TQ028;O657.63

A

1008-021X(2017)11-0088-03