玉米赤霉烯酮降解酶基因mbZHD的原核表達及其降解毒素初步研究

柴成梁 常曉嬌 王楠希 伍松陵 孫長坡

(國家糧食局科學研究院，北京 100037)

玉米赤霉烯酮降解酶基因mbZHD的原核表達及其降解毒素初步研究

柴成梁 常曉嬌 王楠希 伍松陵 孫長坡

(國家糧食局科學研究院，北京 100037)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)是由鐮刀菌屬產生的次生代謝物,是極易污染糧食作物的真菌毒素之一。ZEN具有強烈的雌激素樣效應及致癌性，給人類和動物的健康造成巨大威脅。本研究在NCBI數據庫中進行同源比對，獲得了一些ZHD101降解酶的同源基因，其中，1個來源于真菌——楊盤二孢菌(Marssoninabrunnea)的蛋白序列與ZHD101具有32%的同源性，基因大小為861 bp。通過化學合成方法得到該全長基因，通過構建E.coli原核表達系統進行蛋白表達，蛋白經親和色譜純化后對ZEN分子進行降解活性驗證，HPLC結果表明，該蛋白在6 h內對10 μg ZEN分子的降解率為98%，酶活為200U/mL，從而獲得了1個新的ZEN降解酶基因。

玉米赤霉烯酮 ZEN降解酶基因 克隆 蛋白表達純化

玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)主要是由鐮刀菌屬(Fusariumspecies)產生的次生代謝物，是世界上污染范圍最廣的一種鐮刀菌毒素[1]，易受ZEN污染的糧食作物包括玉米、大麥、小麥、高粱和黑麥等[2]。ZEN的化學名稱為6-(10-羥基-6氧基-十一碳烯基)β-雷鎖酸內酯，其結構與雌性激素雌二醇(estradiol)的結構相似，ZEN能夠與動物細胞膜上的雌激素受體(estrogen receptor，ER)結合，引起ER的構象改變，ZEN/ER復合物被進一步轉移至細胞核內，與雌激素效應元件結合，調節靶基因的轉錄與翻譯，進而影響細胞的生長和分裂[3-4]。ZEN被攝入到哺乳動物體內，可引起哺乳動物陰道炎、假發情及發情周期延長、流產、不育以及畸形等的“高雌性激素癥”(hyperestrogenism)[5-6]。ZEN通過食物鏈在人體內蓄積，可導致性早熟，甚至引起乳腺癌、食管癌等發病率增加[7-8]，對人類健康造成巨大威脅。

微生物降解法消除ZEN污染是利用微生物在代謝過程中產生的酶與ZEN作用，破壞ZEN分子的毒性基團，使其被降解或轉化為無毒產物的過程。生物降解法降解ZEN特異性強、ZEN分子被轉化效率高、不會引起環境污染，因此可科學有效地消除糧食作物中的ZEN污染，具有極好的應用前景[9]。目前國內外關于ZEN的生物降解研究已取得了一定的進展，篩選到了包括細菌、真菌在內的多株具有降解或轉化ZEN活性的微生物[10]。首次將ZEN降解為無毒產物的研究者是El-Sharkawy和Abul-Hajj，他們發現1株絲狀真菌——粉紅粘帚霉Gliocladiumroseum，可將ZEN分子的內酯鍵打開，得到的降解產物無雌性激素活性[11]。日本研究者Takahashi等[12]發現的粉紅粘帚霉ClonostachysroseaIFO7063，可破壞ZEN分子的內酯環，得到的降解產物無雌性激素活性，并通過進一步研究，得到了起降解作用的水解酶，克隆出了編碼水解酶的基因ZHD101。目前，ZHD101蛋白的三維結構已經解析出，明確了ZHD101與ZEN分子的結合方式，為ZHD101在消減糧食中的ZEN污染提供了重要基礎[13]。國內研究者程波財等[14]發現的ZEN降解酶基因ZEN-jjm，以及劉海燕等[15]發現的zlhx-6均對ZEN具有較好的降解效果。

本試驗用ZHD101為模板，在NCBI數據庫中進行序列比對，獲得了一些ZHD101降解酶的同源序列，其中，一個來源于真菌——楊盤二孢菌(Marssoninabrunnea)的蛋白序列與ZHD101具有32%的同源性，基因大小為861 bp。通過化學合成方法得到該全長基因，通過構建PET30a表達載體，轉化BL21(DE3)表達宿主，IPTG誘導進行蛋白表達，蛋白經親和色譜純化后與ZEN分子孵育，進行降解活性驗證，用HPLC方法檢測ZEN分子是否被降解，本研究提供了一個發掘ZEN降解酶的新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 引物和載體

試驗所用引物列于表1中，試驗中連接所用載體為PET30a載體由本實驗室保存，采用限制性內切酶NdeI/XhoI雙酶切，因此用于克隆目的基因的引物中也需要含有NdeI/XhoI、酶切位點或相應的同尾酶酶切位點(XhoI的同尾酶是SalI)。引物序列中包含保護堿基、限制性內切酶識別位點及一段與目的基因匹配的基因序列。

表1 引物列表

1.1.2 試劑、工具酶及培養基

高保真DNA聚合酶和Taq：TAKARA公司；限制性內切酶：TAKARA公司和NEB公司；T4 DNA連接酶：Promega公司；DNA marker和Protein marker：Genstar公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質粒堿裂解法小量提取試劑盒：中科瑞泰公司；dNTP和DNA熒光染料Goldview：北京鼎國昌盛生物技術公司；甲醇、乙腈(色譜純)：北京DIKMA 公司；ZEN標準品：sigma公司。

LB培養基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加去離子水定容至1 L，于121 ℃滅菌20 min，固體培養基加1.5%的瓊脂粉；10×PBS緩沖液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，加去離子水定容至1 L，用鹽酸調pH至7.4，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試驗儀器設備

PCR熱循環擴增儀、電泳槽、恒壓/恒流電泳儀、凝膠成像系統：Bio-rad公司；超聲波破碎儀：美國Sonics公司；恒溫搖床：瑞士Infors公司；高速離心機(低溫)：Thermo公司；高速離心機(室溫)：Eppendorf公司；親和層析介質Ni-NTA：GE公司；e2695高效液相色譜儀、熒光檢測器(2475)、xbridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)：美國Waters公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因合成及體外擴增

根據Genebank中mbZHD的基因序列，委托蘇州金唯智生物科技有限公司對mbZHD基因進行全合成，合成后基因克隆到pUC57 載體上。為表達分析，需將mbZHD基因克隆到PET30a載體上。應用DNASTAR.Lasergene.v7.1進行基因序列分析，設計一對引物如表1所示，引物由睿博興科生物技術有限公司合成。運用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)進行mbZHD的基因的體外擴增，PCR反應體系見表2。

表2 PCR擴增反應體系

PCR反應程序為(1)95 ℃變性5 min；(2)94 ℃變性30 s；(3)54 ℃退火30 s；(4)72 ℃延伸(延伸時間根據基因片斷長度計算)；(5)步驟(2)(4)進行30個循環；(6)72 ℃延伸10 min；(7)20 ℃ 10 min。

1.2.2 重組表達載體的構建

將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產物條帶從瓊脂糖膠上切下，按照中科瑞泰公司DNA回收試劑盒上的步驟進行回收。將回收后的PCR產物在37 ℃進行NdeI/SalI雙酶切。將回收的酶切產物在4 ℃連接入PET30a載體。將連接產物加入100 μL大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，冰上放置30 min，42 ℃熱激90 s后，加入400 μL無抗性的LB培養基，37 ℃、180 r/min培養50 min(復蘇)，然后將菌液涂到卡那霉素(Kanamycin，Kan)抗性的LB平板上，37 ℃放置過夜，次日挑取生長的單菌落進行陽性克隆鑒定。

1.2.3 陽性克隆的獲得

挑取平板上的單菌落于1 mL Kan抗性LB液體培養基中37 ℃培養，3 h后進行PCR陽性克隆篩選。PCR鑒定為陽性后，測序，準確無誤后確定該克隆為陽性克隆，按照中科瑞泰質粒小提試劑盒上的步驟進行質粒抽提，保存于-20 ℃。

1.2.4 mbZHD重組蛋白的誘導表達

將構建好的mbZHD質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，在Kan抗性的LB平板上37 ℃培養過夜，次日挑取單菌落到10 mL LB培養基中在37 ℃培養搖床中200 r/min培養至較為混濁時，轉接到1 L LB培養基中繼續培養，待細菌生長到OD值為1左右時，將搖床溫度降至15 ℃，加入0.5 mL濃度為0.6 mol/L的IPTG誘導表達過夜，次日收菌純化蛋白。

1.2.5 mbZHD重組蛋白的純化

將過夜表達的菌體離心收集，棄上清，加入30 mL重懸緩沖液，將細菌沉淀懸起后超聲破碎細菌，將破碎的細胞懸液轉入高速離心管中，高速離心后把上清加入到Ni-NTA親和柱中，讓其流過親和介質。用10倍柱體積的漂洗緩沖液漂洗親和介質，洗掉非特異性結合的雜蛋白，用5 mL 洗脫緩沖液將目的蛋白從親和柱上洗脫下來，-80 ℃保存。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行mbZHD蛋白的表達純化分析。

1.2.6 ZEN降解酶活性測定

取純化的mbZHD蛋白50 μL，加入到含ZEN質量濃度為10 μg/mL的eppendorf管中，以不加mbZHD蛋白的同濃度ZEN溶液作對照，37 ℃反應6 h，100 ℃加熱10 min終止反應，用旋轉蒸發儀蒸干反應體系，加入1 mL甲醇，超聲萃取，經0.22 μm濾膜過濾后，用高效液相色譜檢測，根據ZEN濃度的變化來分析mbZHD蛋白對ZEN是否具有降解活性。高效液相色譜檢測ZEN的色譜條件為：色譜柱：C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，xbridge) ；流動相：超純水/色譜級乙腈=50/50(V/V)；流動相流速：1.0 mL/min；色譜柱溫度設定：25 ℃；進樣量：10 μL； 熒光檢測器：激發波長(Ex)∶ 274 nm，發射波長(Em)∶ 440 nm；采集時間：13 min。

ZEN生物降解率的計算方法：取純化的mbZHD蛋白，加入到含ZEN質量濃度為10 μg/mL的eppendorf管中(反應組)，以不加mbZHD蛋白的同濃度ZEN溶液作對照，終止反應后，用高效液相色譜檢測，對照組樣品和反應組樣品的ZEN收峰面積之差即為降解掉的ZEN。

測得的酶活性用酶活單位U/mL表示，1 U/mL酶活定義為1 mL純化后的酶液在1 min內降解1 ng ZEN毒素。

2 結果與分析

2.1 mbZHD基因序列的獲得

以ZEN降解酶ZHD101(264 aa)為模板，在NCBI數據庫中進行同源比對，獲得1個可能降解ZEN分子的降解酶基因mbZHD，該基因來源于1株真菌——楊盤二孢菌，表達產物為286個氨基酸。通過將mbZHD與ZHD101比對發現，mbZHD與ZHD101具有32%的同源性，如圖1所示。

2.2 mbZHD基因PCR

按表2的PCR反應體系，以合成的mbZHD全長基因為模版，通過PCR方法擴增mbZHD(1-286 aa)基因，PCR結果如圖2所示。

2.3 陽性克隆的獲得

將構建好的質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，涂布Kan抗性LB平板，挑取生長的單菌落進行菌落PCR鑒定，結果如圖3所示。PCR鑒定為陽性后，測序，準確無誤后確定該克隆為陽性克隆。

注：黑色標記的氨基酸為2蛋白中的相同氨基酸；黑色方框內的氨基酸為2蛋白中性質相似氨基酸；無標記的氨基酸為2蛋白中不相同氨基酸。圖1 mbZHD與ZHD101蛋白序列比對圖

注：1泳道是目的基因mbZHD；M為DNA Marker。圖2 mbZHD基因瓊脂糖凝膠電泳

注：1泳道為空質粒對照；2、3、4泳道為轉入含目的基因質粒的單菌落；M為DNA Marker。圖3 陽性克隆的PCR鑒定

2.3 mbZHD蛋白的表達純化

將過夜表達mbZHD蛋白的菌體超聲破碎，轉入高速離心管中高速離心后，把上清用Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白。因為目的蛋白mbZHD融合有組蛋白標簽，能與Ni-NTA親和介質結合，從而與雜質蛋白分開，然后用高濃度咪唑將目的蛋白從Ni-NTA親和介質上洗脫下來，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行mbZHD蛋白的表達純化分析，根據目的蛋白的大小判斷其在凝膠上的位置，結果如圖4所示。

注：1泳道是表達mbZHD蛋白的菌體超聲破碎后的樣品；2泳道是從Ni-NTA親和柱上洗脫下來的樣品；M是Protein Marker。圖4 mbZHD蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.4 mbZHD蛋白對ZEN的降解活性測定

取純化的mbZHD蛋白50 μL，加入到含ZEN質量濃度為10 μg/mL的eppendorf管中(反應組)，以不加mbZHD蛋白的同濃度ZEN溶液作對照，37 ℃反應6 h后，用高效液相色譜檢測，在上述色譜條件下，對照組樣品在保留時間RT=10.715 min處有強吸收峰，而反應組樣品基本無ZEN目標峰檢出，經吸收峰面積計算，已有98%的ZEN分子被降解，降解酶酶活為2×102U/mL。

注：在保留時間RT=10.715 min處，無吸收峰(實線)的是反應組樣品，有吸收峰(虛線)的是對照組樣品。圖5 反應組樣品與對照組樣品HPLC圖

3 討論與結論

本研究以ZEN降解酶ZHD101(264aa)為模板，在NCBI數據庫中進行同源比對，獲得1個可能降解ZEN分子的降解酶基因mbZHD，該基因來源于1株真菌——楊盤二孢菌，表達產物為286個氨基酸。通過構建E.coli原核表達系統進行蛋白表達，蛋白經純化后對ZEN分子進行降解活性試驗，結合高效液相色譜檢測，證實了該蛋白具有降解ZEN活性，從而發現了1個新的ZEN降解酶基因，說明通過在NCBI數據庫中進行同源比對從而發現ZEN降解酶基因的方法確實可行。

通過將mbZHD與ZHD101比對發現，mbZHD與ZHD101具有32%的同源性。通過在相同降解酶濃度條件及相同的酶活定義下，比較ZEN降解酶mbZHD、ZHD101、ZEN-jjm對ZEN的降解活性發現，mbZHD對ZEN的降解活性為200 U/mL，而ZHD101與ZEN-jjm對ZEN的降解活性為mbZHD的2倍，即為400 U/mL。顯然，分析造成這些降解酶對ZEN降解活性存在差異的原因尤為重要。下一步的工作是試圖解析mbZHD的蛋白結構，通過比較mbZHD與ZHD101的結構差異以及對ZEN的降解活性差異，來判斷此類水解酶的哪些氨基酸殘基對降解ZEN分子起到關鍵作用，以此為依據對ZEN降解酶進行分子改造，提高降解酶活性，為ZEN降解酶在消減糧食及其副產物中的ZEN污染提供基礎。

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Preliminary Study on Prokaryotic Expression and Its Degradation Activity of a New Zearalenone-Degradation Enzyme(mbZHD)

Chai Chengliang Chang Xiaojiao Wang Nanxi Wu Songling Sun Changpo

(Academy of State Administration of Grain，Beijing 100037)

Zearalenone (ZEN) was a mycotoxin produced mainly by fungi belonging to the genusFusariumwhich frequently contaminated crops. ZEN had an intense estrogen-like effects and was extremely carcinogenic, which posed great threats to the health of animals and human. Through homologous alignment in NCBI, some homologous

sequences of ZHD101 degradation enzyme were found, and one of them which came from fungus -protein sequences ofMarssoninabrunnea-was found to be 32% homologic to ZHD101, and the gene size was 861bp. To determine its ZEN-degrading activity, the full-length gene was obtained by chemical synthetic method, and the protein expression was made by constructingE.coliExpression System HPLC results showed that the degradation rate of protein aganst 10 μg ZEN within 6 h was 98%; the enzyme activity was 200 U/mL and a new ZEN-degradation enzyme was successfully obtained.

zearalenone，ZEN-degradation enzyme，gene cloning，protein expression and purification

國家科技支撐計劃(2015BAK43B01)，公益性行業(糧食)科研專項(201513006)

2016-06-17

柴成梁，男，1984年出生，助理研究員，生物化學與分子生物學

孫長坡，男，1975年出生，研究員，糧油微生物與質量安全

Q71

：A

：1003-0174(2017)08-0029-06