基于細胞層面表征的室內(nèi)用白光LED光生物安全測試方法研究

王 琪，焦 洋，宋佳音

(1.天津大學建筑學院，天津 300072；2.天津市建筑物理環(huán)境與生態(tài)技術(shù)重點實驗室，天津 300072；3.國網(wǎng)冀北電力有限公司秦皇島供電公司，河北 秦皇島 066000)

基于細胞層面表征的室內(nèi)用白光LED光生物安全測試方法研究

王 琪1, 2，焦 洋3，宋佳音1, 2

(1.天津大學建筑學院，天津 300072；2.天津市建筑物理環(huán)境與生態(tài)技術(shù)重點實驗室，天津 300072；3.國網(wǎng)冀北電力有限公司秦皇島供電公司，河北 秦皇島 066000)

LED技術(shù)目前正處在高速發(fā)展時期，其應用領(lǐng)域正逐漸由室外照明領(lǐng)域向室內(nèi)照明領(lǐng)域擴展，并有望成為普通室內(nèi)照明的主要光源，室內(nèi)用白光LED的光生物安全性已成為建筑光環(huán)境領(lǐng)域的前沿問題。本研究首先結(jié)合本項目前期的成果，以熒光粉激發(fā)白光LED作為實驗光源，以四種人體皮膚和眼睛細胞作為實驗細胞，運用MTT比色法對不同輻照時長和不同輻照強度下的光生物安全性評價指標——細胞活力進行了檢測實驗；然后對實驗原始數(shù)據(jù)進行科學地篩選和分析，得到不同輻照時長和強度對細胞活力的影響結(jié)果；最后以此建立起了一種全面、快速、準確的室內(nèi)用白光LED照明產(chǎn)品光生物安全性測試方法。

室內(nèi)照明；白光LED；光生物安全；MTT比色法；細胞活力

引言

照明科學是針對人與光之間需求關(guān)系的研究，包括視覺器官的感知和非視覺兩個方面。而人工光源是其中的紐帶，常見的人工光源包括熱輻射光源(普通白熾燈、鹵鎢燈)和氣體放電光源(熒光燈、高壓鈉燈、高壓汞燈、金鹵燈等)及固態(tài)光源(包括發(fā)光二極管、有機發(fā)光二極管等)。其中，發(fā)光二極管(LED)和有機發(fā)光二極管(OLED)是20世紀末新出現(xiàn)的半導體照明光源，其技術(shù)目前正處在高速發(fā)展時期[1]。在全球能源危機不斷加劇的背景下，世界各國紛紛倡導使用具有諸多優(yōu)點的LED照明產(chǎn)品；同時，在產(chǎn)業(yè)資本和政府補貼政策的雙重推動之下，其應用領(lǐng)域正由室外照明領(lǐng)域向室內(nèi)照明領(lǐng)域發(fā)展，并正在取代傳統(tǒng)的白熾燈和熒光燈等，成為室內(nèi)照明的首選光源[2-4]。隨著人們對自身健康重視度和對光生物輻射效應了解的提高，LED光源光生物安全性已逐漸成為了公眾和照明領(lǐng)域?qū)＜宜接懙臒狳c問題。在此背景下，用于室內(nèi)照明中的LED照明產(chǎn)品，尚未經(jīng)過長期使用的驗證，人們對其光生物安全性的關(guān)注更是達到了前所未有的程度[3-4]。

光生物安全性研究的是光輻射與生物機體的相互作用。包括光輻射在內(nèi)的輻射安全已被世界衛(wèi)生組織列為繼水源、空氣、噪音之后人類所面臨的第四大環(huán)境安全問題[3]。目前國內(nèi)外相關(guān)機構(gòu)已經(jīng)發(fā)布了一系列關(guān)于LED照明產(chǎn)品的光生物安全性的標準：國際照明委員會(CIE)在2002年發(fā)布了標準CIE S 009 /E:2002《Photobiological safety of lamps and lamp systems》；國際電工委員會(IEC)在2006年發(fā)布了標準IEC 62471:2006《Photobiological safety of lamps and lamp systems》；我國在2006年發(fā)布了標準GB/T 20145—2006《燈和燈系統(tǒng)的光生物安全性》，在2016至2017年相繼發(fā)布了標準CSA 035.1—2016《LED 照明產(chǎn)品視覺健康舒適度測試 第1部分：概述》、CSA 035.2—2017《LED照明產(chǎn)品視覺健康舒適度測試 第2部分：測試方法——基于人眼生理功能的測試方法及技術(shù)要求》、CSA 035.3—2017《LED照明產(chǎn)品視覺健康舒適度測試 第3部分：測試方法——基于眼底功能的測試方法及技術(shù)要求》[5-10]。同時，國內(nèi)外也已經(jīng)有很多相關(guān)領(lǐng)域的學者對LED照明產(chǎn)品的光生物安全性進行了研究，主要集中于LED的藍光危害方面，且實驗多處于人體或動物的器官或組織層面，細胞層面的實驗又多選用人體或動物眼部細胞[11-14]。

綜上所述，目前對于LED照明產(chǎn)品的光生物安全性的評價，尚缺少針對室內(nèi)用白光LED照明產(chǎn)品的光生物安全性基于人體細胞層面表征的全面研究及相應的測試方法。本研究通過室內(nèi)用白光LED照明產(chǎn)品對人體皮膚和眼睛細胞的一系列光照實驗，探尋一種可以全面、快速、準確地反映室內(nèi)用白光LED照明產(chǎn)品光生物安全性的測試方法。

1 實驗設計

1)光源。根據(jù)本項目前期對我國市場中常見的和建筑空間中普遍使用的LED光源的調(diào)研結(jié)果，本實驗選取熒光粉激發(fā)白光LED(3 000 K、4 000 K)作為實驗光源，并配置靈活可控的控制器以實現(xiàn)無極調(diào)光功能。

2)細胞。由于光輻射會被人體組織強烈地吸收，并且能有一定深度(紫外穿透深度約為幾個微米，紅外穿透深度約為幾個毫米)，人體的皮膚和眼睛是暴露在光輻射的威脅之下的。所以就人體而言，應主要考慮光輻射對皮膚、眼睛前表面(眼角膜、眼結(jié)膜、晶狀體)和視網(wǎng)膜的危害[3]。故本實驗選取下述四種細胞作為實驗細胞：兩種人體皮膚細胞——人永生化角質(zhì)細胞HaCat和男性正常龜頭細胞系HS68、兩種人體眼睛細胞——人晶狀體上皮細胞SRA01/04和人視網(wǎng)膜色素上皮細胞D407。

3)輻照時長和強度。光輻射的生物反應一般可分為光化學作用和熱作用。由于短波區(qū)域的光子能量高，光化學主要在短波區(qū)域起作用，而熱作用則在長波區(qū)域占主導地位。在光化學作用中，細胞分子中的電子吸收一些特定波長的光子后，光會激發(fā)電子躍遷，從而導致該區(qū)域的化學鍵斷裂和重組，進而對DNA產(chǎn)生影響。熱反應的機理則是某些部位吸收了光，使得局部溫度上升，導致蛋白質(zhì)變性或細胞熱損傷。光化學作用和熱作用的不同在于，低強度的熱輻射導致的熱反應會隨著熱從被照射部位傳導至其他部位而減低，而光化學反應取決于劑量，低強度長期照射與高強度短期照射造成的傷害是一樣的[3]。綜合考慮上述因素，本實驗選取1 h、2 h、3 h三檔時長作為實驗輻照時長，選取20 W/m2、40 W/m2、60 W/m2、80W/m2、100 W/m2五檔輻照強度作為實驗輻照強度。

4)光生物安全性評價指標。

①光生物安全性評價指標的確定。本項目前期曾進行過室內(nèi)照明系統(tǒng)中不同光源照射下哺乳動物細胞的光細胞毒性研究：該研究選取猴脈絡膜-視網(wǎng)膜(內(nèi)皮)細胞RF/6A、男性正常龜頭細胞系HS68和小鼠胚胎成纖維細胞3T3-L1作為實驗細胞；選取白熾燈、LED(5 000 K)、UVA和UVB作為實驗光源并設置一組不受實驗光源照射的對照組；在一定的輻照強度下進行一定時長的照射，然后分別檢測實驗細胞的細胞活力、乳酸脫氫酶(LDH)釋放量、活性氧(ROS)生成量、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)水平等六項光生物安全性評價指標[15]。研究結(jié)果如圖1所示。

圖1 室內(nèi)照明系統(tǒng)中不同光源照射下哺乳動物細胞的光細胞毒性研究結(jié)果(來源：文獻[15])Fig.1 The study results of the photocytotoxicity of different lights on mammalian cells in interior lighting system (from reference[15])

從圖1中可看出，在三種實驗細胞的細胞活力、乳酸脫氫酶(LDH)釋放量、活性氧(ROS)生成量、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)水平等六項光生物安全性評價指標的檢測結(jié)果中，細胞活力這一指標在不同實驗光源間差異均最為顯著，完全具備光生物安全性評價指標所需的直接、快速、靈敏、穩(wěn)定等特點，因此，本實驗選取細胞活力作為實驗光源的光生物安全性評價指標。

②細胞活力檢測方法。本實驗選取MTT比色法作為實驗細胞的細胞活力的檢測方法。MTT，即溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑 [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipenyl terazolium bromide]，簡稱四唑鹽，又名噻唑藍。MTT產(chǎn)品為淡黃色粉末，易被水溶解和透過細胞膜而進入細胞內(nèi)，可被活細胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原，形成不溶于水的藍紫色甲臢(Formazam)結(jié)晶。該結(jié)晶可溶于酸性異丙醇、二甲基亞砜(DMSO)、SDS等有機溶劑中，通過多孔掃描分光光度計依顏色深淺可測定出各吸光度值。由于結(jié)晶物形成的量與細胞數(shù)量及代謝活性成比例，因此吸光度值的大小可反映細胞的數(shù)量及活性，吸光度值越大，細胞活力越強。MTT比色法靈敏度高且快速、準確、重復性好[16-17]。

2 實驗過程

1)接種細胞。使用與酶標儀匹配的96孔培養(yǎng)板，測定細胞增殖每孔體積200 μl含約5 000～10 000個細胞，注意設置六個重復孔。

2)培養(yǎng)細胞。人晶狀體上皮細胞SRA01/04使用RPM1640培養(yǎng)基(含10%FBS、1%雙抗)，人永生化角質(zhì)細胞HaCat、男性正常龜頭細胞系HS68和人視網(wǎng)膜色素上皮細胞D407使用DMEM-H培養(yǎng)基(含10%FBS，1%雙抗)，在溫度為37℃±0.5 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后給予特定的物理因素刺激：光照。

3)光照處理。

①不同輻照時長。進行輻照強度為60 W/m2，輻照時長分別為1 h、2 h、3 h的光照處理。

②不同輻照強度。進行輻照時長為兩種人體皮膚細胞1 h、兩種人體眼睛細胞2 h，輻照強度為分別為20 W/m2、40 W/m2、60 W/m2、80 W/m2、100 W/m2的光照處理。

4)呈色。光照處理結(jié)束后，每孔200 μl培養(yǎng)基加入20 μl MTT(5 mg/ml)，在溫度為37 ℃±0.5 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。然后終止培養(yǎng)，小心吸出培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μl DMSO，置于搖床上低速振蕩使結(jié)晶物充分溶解。

5)比色。選擇492 nm波長測定，在Multiskan MK3型酶標儀(Thermo)上測定各孔吸光度值并記錄結(jié)果。

6)計算細胞增殖率。

式中ρ為細胞增殖率，E為光照處理組的平均吸光度值，Eo為同樣環(huán)境中不做光照處理的對照組的平均吸光度值。

3 實驗結(jié)果

3.1 不同輻照時長對細胞活力的影響

結(jié)合表1和圖2可以看出，相較于同樣環(huán)境中不做光照處理的對照組，進行了不同輻照時長的光照處理的細胞其活力均會受到影響，且大部分情況下細胞活力減弱。對于人永生化角質(zhì)細胞HaCat和男性正常龜頭細胞系HS68這兩種人體皮膚細胞來說，在輻照時長為1h時，其細胞活力最弱，與對照組之間的差異最為顯著；對于人晶狀體上皮細胞SRA01/04和人視網(wǎng)膜色素上皮細胞D407這兩種眼睛細胞來說，在輻照時長為2h時，其細胞活力最弱，與對照組之間的差異最為顯著。

3.2 不同輻照強度對細胞活力的影響

結(jié)合表2和圖3可以看出，相較于同樣環(huán)境中不做光照處理的對照組，進行了不同輻照強度的光照處理的細胞其活力均會受到影響，且大部分情況下細胞活力減弱。對于人永生化角質(zhì)細胞HaCat、男性正常龜頭細胞系HS68、人晶狀體上皮細胞SRA01/04和人視網(wǎng)膜色素上皮細胞D407這四種細胞來說，其細胞活力均隨著輻照強度的增大先減弱后增強，在輻照強度為60W/m2時，其細胞活力最弱，與對照組之間的差異最為顯著。

表1 不同輻照時長對細胞活力的影響

表2 不同輻照強度對細胞活力的影響

圖2 不同輻照時長對細胞活力的影響Fig.2 The effects of different irradiation hours on cell viability

圖3 不同輻照強度對細胞活力的影響Fig.3 The effects of different irradiation intensities on cell viability

4 結(jié)論與展望

本研究以熒光粉激發(fā)白光LED作為實驗光源，以人永生化角質(zhì)細胞HaCat、男性正常龜頭細胞系HS68、人晶狀體上皮細胞SRA01/04和人視網(wǎng)膜色素上皮細胞D407四種人體細胞作為實驗細胞，采用MTT比色法對1 h、2 h、3 h三檔輻照時長和20 W/m2、40 W/m2、60 W/m2、80 W/m2、100 W/m2五檔輻照強度下的光生物安全性評價指標進行了檢測。根據(jù)前面得到的研究結(jié)果，可以得出如下結(jié)論：

1)通過本項目前期曾進行過的室內(nèi)照明系統(tǒng)中不同光源照射下哺乳動物細胞的光細胞毒性研究結(jié)果，確定基于細胞層面表征的室內(nèi)用白光LED光生物安全測試方法的光生物安全性評價指標為細胞活力，細胞活力的檢測方法為MTT比色法。

2)通過本研究不同輻照時長對細胞活力的影響的實驗結(jié)果，確定基于細胞層面表征的室內(nèi)用白光LED光生物安全測試方法的輻照時間為皮膚細胞1 h、眼睛細胞2 h。

3)通過本研究不同輻照強度對細胞活力的影響的實驗結(jié)果，確定基于細胞層面表征的室內(nèi)用白光LED光生物安全測試方法的的輻照強度為60 W/m2。

綜上所述，本文通過對室內(nèi)用白光LED照明產(chǎn)品的光生物安全性基于人體細胞層面表征的全面研究，建立起了一種全面、快速、準確的室內(nèi)用白光LED照明產(chǎn)品光生物安全性測試方法，如表3所示。

表3 基于細胞層面表征的室內(nèi)用白光LED光生物安全測試方法

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Study on Photobiological Safety Testing Methods of White LED for Indoor Lighting Based on Cellular Level Characterization

WANG Qi1, 2, JIAO Yang3, SONG Jiayin1, 2

(1.SchoolofArchitecture,TianjinUniversity,Tianjin300072,China; 2.TianjinKeyLaboratoryofArchitecturalPhysicsandEnvironmentalTechnology,Tianjin300072,China; 3.StateGridJibeiElectricPowerCompanyQinhuangdaoPowerSupplyCompany,Qinhuangdao066000,China)

LED technology is currently in a period of rapid development. Its application areas are gradually expanding from the field of outdoor lighting to the field of indoor lighting, and it is expected to become the main light source for ordinary indoor lighting. Photobiological safety of white LED for indoor lighting has become a frontier issue in the field of building light environment. Firstly, in this study, combined with the early results of the project, phosphor excited white LED is used as the experimental light source, and four kinds of human skins and eye cells are used as experimental cells, then MTT colorimetric assay is used to conduct the detection experiment of photobiological safety evaluation index: cell viability, in different irradiation hours and under different irradiation intensities. Secondly, the original data of the experiment are scientifically screened and analyzed to obtain the effect of different irradiation hours and intensities on cell viability. Finally, a comprehensive, fast and accurate photobiological safety testing method of White LED for indoor lighting is established.

indoor lighting; white LED; photobiological safety; MTT colorimetric assay; cell viability

國家自然科學基金青年科學基金項目：“基于細胞層面表征的室內(nèi)用WLED光生物安全研究” (51408405)；天津市應用基礎與前沿技術(shù)研究計劃青年項目：“人工光源LED光生物安全性痕量檢測方法研究” (15JCQNJC07500) 通訊作者：宋佳音，E-mail:zuro@vip.sina.com

TM923.34

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10.3969/j.issn.1004-440X.2017.04.015